基于網絡藥理學探討桂芍配伍治療骨關節炎的作用機制

陳譜 阮安民 周俊 張曉哲 王慶甫

桂枝與白芍配伍最早見于《傷寒論》，張仲景在桂枝湯的基礎上，運用不同比例的桂枝與白芍，衍化出了小建中湯、桂枝加葛根湯等著名方劑。在前期研究中筆者對比了不同比例的桂枝與白芍對骨關節炎(Osteoarthritis，OA)中滑膜炎癥的影響，結果顯示“桂枝—白芍”配伍可以顯著抑制骨關節炎滑膜炎癥程度[1-2]。然“桂枝—白芍”配伍究竟如何影響到骨關節炎，其內在作用機制尚未見報道。網絡藥理學是一種利用現有文獻基礎和網絡生物信息學，從多成分、多靶點以及多通路的角度出發，構建“藥物—成分—靶點—疾病”網絡，探討多種中藥成分與疾病之間的相互作用機制，比較適合單味中藥及復方研究的新興學科[3-4]。因此本研究擬通過網絡藥理學技術初步探討“桂枝—白芍”配伍對骨關節炎的作用機制，為后續研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 獲取桂枝—白芍藥對活血成分及潛在治療靶點

中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)數據庫[5]是一種基于傳統中草藥系統藥理學而建立的中藥系統藥理學數據庫與分析平臺，能捕捉藥物、靶標和疾病之間的關系，其內包括499味中藥以及29000個中藥有效成分。藥物成分靶標數據庫(herb ingredients’ targets，HIT)[6]是一個包括用于補充美國食品及藥物管理局(Food and Drug Administration,FDA)批準的藥物的蛋白質靶標和有潛在治療意義的數據庫，包含大約1301個已知的蛋白質靶點，涵蓋了1300多種著名中草藥中的約586種活性化合物。筆者通過在TCMSP數據庫中搜索“桂枝”“白芍”，根據口服利用度(Oral bioavailability,OB)≥30%以及類藥性(Drug-Likeness,DL)≥0.18進行篩選，將得到的生物活血成分進行整理并統計活性成分相對應的靶基因。再將得到的活性成分放入HIT中進行檢索，再次收集活性成分相對應的靶基因，使用Excel整理數據。

1.2 骨關節炎治療靶點獲取

治療靶點數據庫(Therapeutic Target Database，TTD)[6]以及Drug Bank數據庫[7]是兩個常用的包括疾病靶點和藥物信息的數據庫，既有成功的臨床藥物靶點，亦有在研藥物靶點，其內信息均經過試驗驗證，具有較強的可行性。Gene Cards[8]是一個整和網絡資源的基因數據庫，內有全面的所有關于人類的基因注釋信息和預測信息，信息較全。筆者在這三個數據庫中以“osteoarthritis”為檢索詞，獲取每個靶點的全稱、簡稱以及UniProt號，使用Excel將得到的靶點信息進行整和。

1.3 構建“藥物—成分—靶點—疾病”網絡

將骨關節炎治療靶點與桂枝、白芍藥對治療靶點用Excel進行合并，提取出重復值，重復值即為桂枝—白芍藥對治療OA的靶點。以藥物有效成分和桂枝—白芍藥對治療OA的靶點為節點，在Excel表格中建立關系，導入Cytoscape 3.7.2軟件中建立“桂枝—白芍”與治療靶點之間的相互作用網絡。

1.4 KEGG通路富集分析

將桂枝—白芍藥對治療OA的靶點在David網站[9]中進行KEGG(京都基因與基因組百科全書)富集，使用R語言對P值進行校正并選擇前20條通路進行氣泡圖展示，進一步探討桂枝—白芍治療OA過程中的信號通路。

1.5 GO富集分析

在Cytoscape軟件中下載安裝“BiNGo”以及“MCODE”插件。首先對桂枝—白芍藥對治療OA的靶點進行基因本體(Gene Ontology，GO)生物過程富集，包括生物學過程(BP，Biological Process)、細胞組分(CC，Cellular Component)、分子功能(MF，Molecular Function)，對P值進行校正后再對所有具有統計學意義的GO生物過程進行富集分析。

2 結果

2.1 桂枝—白芍藥對活血成分及潛在治療靶點

在TCMSP數據庫中，以口服利用度(OB)≥30%以及類藥性(DL)≥0.18為篩選條件檢索到7種桂枝有效成分、13種白芍有效成分，且桂枝與白芍之間具有3個共同有效成分，具體詳見表1～2。將檢索到的有效成分在TCMSP及HIT數據庫上收集相應的治療靶點，Excel整理查重后共有90個治療靶點。

表1 TCMSP數據庫中桂枝有效成分

表2 TCMSP數據庫中白芍有效成分

2.2 桂枝白芍治療骨關節炎靶點

通過檢索TTD、DrugBank以及GeneCards數據庫，在GeneCards數據庫中以分值≥1為篩選條件，Excel整理取出重復值，共篩選出骨關節炎潛在治療靶點1307個。將桂枝—白芍藥對治療靶點與骨關節炎治療靶點進行匹對，共發現靶點40個，詳見表3。

表3 桂枝—白芍藥對治療骨關節炎靶點

續表3

2.3 “藥物—成分—靶點—疾病”網絡

將桂枝與白芍的每個有效成分和其相對應治療靶標導入Cytoscape軟件中，繪制成分—靶點對應圖形，以淺黃色為自由度較小的顏色，紅色為自由度較高的顏色。結果顯示桂枝—白芍藥對中前五位活血成分一次為MOL000358(β-谷甾醇)、MOL000422(山柰酚)、MOL000359(谷甾醇)、MOL000492(兒茶酸)、MOL004576(黃杉素)，詳見圖1。

注：圖中方形代表藥物成分，圓形代表靶點

2.4 KEGG通路富集分析

將關鍵靶基因在David網站中進行KEGG通路富集，共富集出通路93條，使用R語言對P值進行校正并選擇前20條通路進行氣泡圖展示，見圖2。結果顯示桂枝—白芍藥對治療OA的信號通路包括癌癥、乙型肝炎、腫瘤壞死因子等通路，還包括細胞凋亡、結直腸癌、Toll樣受體等信號通路。

圖2 KEGG通路富集分析

2.5 GO富集分析

將獲得的關鍵靶基因放入David網站上進行GO富集分析，選擇生物學過程(Biological Process,BP)、分子功能(Molecular Function,MF)以及細胞組分(Cellular Component,CC)三個內容。分析結果如圖3～5所示，桂枝白芍的靶點在BP上主要是在藥物反應、雌二醇、衰老以及激活NF-κB信號通路等；在MF上主要表現為類固醇激素受體活性、單氧酶活動以及過氧化物酶活性；在CC上主要位于胞質、膜筏及細胞器膜上。

圖3 GO富集分析—生物學過程(BP)

圖4 GO富集分析—分子功能(MF)

圖5 GO富集分析—細胞組分(CC)

3 討論

OA是一種以滑膜炎癥、軟骨進行性退變并累計關節軟骨下骨的退行性肌肉骨骼疾病，其主要癥狀有關節疼痛、僵硬以及功能障礙[10-12]。國際衛生組織發布的流行病學顯示OA是全世界十大致殘原因之一[10]，隨著中國逐步步入老齡化社會，中國OA患者也呈逐年增加的趨勢。雖然治療OA的方法眾多，然目前仍無一種方法可以逆轉或者暫止OA的發生與發展[12-15]。因此研究OA的發病機理，探索治療OA的作用機制具有重要社會意義。

“桂枝—白芍”是中醫學常見的配對用藥之一，桂枝辛散調衛陽，白芍酸澀和營陰，桂芍配伍可調和營衛、溫經和血。張仲景即在黃芪桂枝五味湯中連用桂芍，取其調營衛、治陰陽以治陰陽舉微之血痹?，F代藥理學顯示，桂枝中的有效單體桂皮醛具有顯著的抑制炎癥、免疫調節、抗氧化、抗糖尿病等作用[16-18]；白芍的提取物白芍總苷可以抗炎止痛、調節免疫[19-22]。筆者團隊在傳承經典的基礎上，結合現代藥理學證據，以“桂枝—白芍”為君藥組方通絡止痛方，取其抑制炎癥、調節免疫之效用于治療OA，取得顯著效果。在北京市科委和國自然的資助下，團隊在不同層面上對通絡止痛方上治療OA的療效進行了驗證[1-2，23-24，26-29]。在細胞層面上，通絡止痛方可以顯著抑制滑膜細胞炎癥，其中君藥有效成分可以抑制滑膜細胞增殖并促進其凋亡，且桂枝白芍聯合用藥效果顯著高于單味組[22，25，27]；在動物層面上，低頻超聲促透通絡止痛方可以顯著抑制大鼠膝骨關節炎骨關節炎中的炎性因子表達[28-29]；在臨床研究上，超聲電導通絡止痛方可以顯著降低早期膝骨關節炎患者疼痛評分并提高患肢功能[25]。然而通絡止痛方如何治療OA，君藥“桂枝—白芍”通過哪些信號通路影響到OA，目前暫不清楚。

本文從網絡藥理學及生物信息學出發，探討“桂枝—白芍”藥對治療骨關節炎的潛在治療機制。本次研究在“桂枝—白芍”藥對中共檢索出17種有效治療成分，映射治療OA靶標40個。在“藥物—成分—靶點—疾病”網絡中發現有5種有效成分最為顯著，即β-谷甾醇、山柰酚、谷甾醇、兒茶酸和黃杉素，而其中有3種有效成分同時存在于桂枝與白芍之中，這可能是“桂枝—白芍”聯合用藥效果更佳的潛在原因。KEGG通路富集分析顯示其潛在治療可能與癌癥、乙型肝炎、腫瘤壞死因子通路有關，在這些通路中MAPK、Jak/STAT、ERK、NF-κB以及自噬等經典通路相互交聯。GO富集分析顯示“桂枝—白芍”在生物學過程中主要是激活藥物反應應答、衰老、抗氧化以及調節NF-κB通路、ERK信號通路等；在分子功能上主要是激活類固醇激素受體與過氧化物酶活性，這與KEGG結果顯示相符，也與之前文獻報道相吻合。

綜上所述，本研究以經典藥對“桂枝—白芍”為研究對象，利用網絡藥理學和生物信息學相關技術，探討了“桂枝—白芍”藥對所包含的有效成分以及治療骨關節炎的潛在靶點及相關信號通路，構建藥物成分靶點網絡并進行KEGG和GO富集分析，闡述了“桂枝—白芍”治療骨關節炎的潛在作用機制，為進一步深入研究“桂枝—白芍”藥對作用提供了參考。