銀甘湯對轉化生長因子-β1重組腺病毒載體誘導肺纖維化小鼠的干預作用及機制研究

夏瑤丹 曹芳 楊浩婕 李國棟 顧瀟楓 劉浩歌 龐慶祿 焦揚

特發性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一種原因不明的，病情呈進行性加重的間質性肺疾病，主要臨床表現為漸進性、不可逆的呼吸困難，死亡率高，目前西醫尚未有理想有效的藥物。轉化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)是目前研究發現的最主要的致纖維化因子，由哺乳動物的巨噬細胞等合成并釋放。Patricia J.Sime等[1]首次利用腺病毒載體將TGF-β1轉入大鼠體內，成功復制出肺纖維化模型。經過多年臨床觀察[2-3]及實驗研究[4-5]，已證實肺痹湯對肺纖維化有顯著改善作用。本研究所用銀甘湯由金銀花和生甘草組成，均是肺痹湯的主要組成部分，方中金銀花辛涼解表，清熱解毒，現代藥理研究證實有抗炎、調節免疫作用[6]；生甘草清熱解毒，祛痰止咳，調和諸藥，現代藥理研究證實有抗炎、抗纖維化、調節免疫作用[7-8]。本實驗在前期研究基礎上，以TGF-β1重組腺病毒載體誘導肺纖維化小鼠模型為研究對象，觀察銀甘湯對小鼠肺纖維化的影響，探討其作用機制，為臨床治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級C57BL/6雄性小鼠40只，7～8周齡，體重(22±2)g，購自斯貝福(北京)生物技術有限公司，動物生產許可證編號：SCXK(京)2016-0002，所有小鼠飼養于北京中醫藥大學科研中心動物室，環境溫度20～25℃，相對濕度60%～70%，12小時/12小時明暗周期照射，自由飲水與進食。適應性喂養一周后使用。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 主要試劑 銀甘湯制備：銀甘湯顆粒劑按照金銀花與生甘草3∶1比例制備，每付顆粒40 g，購自北京康仁堂藥業有限公司。將顆粒劑用100度開水沖泡后，調整濃度為0.6007 g/mL。質粒小量快速提取試劑盒(離心柱型)(北京艾德萊生物科技有限公司)；限制性內切酶類(美國Thermo Fisher Scientific公司)；DNA Ligase(北京合生基因科技有限公司)；腺病毒包裝試劑盒(北京合生基因科技有限公司)；EpFectTMTransfection Reagent(北京合生基因科技有限公司)；EvaGreen?qPCR 2×Master Mix(北京合生基因有限公司)；DMEM高糖培養基(美國Gibco公司)；RPMI 1640培養基(美國Gibco公司)；胎牛血清(美國Gibco公司)。Trizol(Invitrogen；批號：10296028)；DEPC水(MDL；批號：md911875)；超純瓊脂糖(ABI-invitrogen；批號：16500100)；反轉錄試劑盒(ABI-invitrogen；批號：11752050)；SYBR qPCR mix(ABI-invitrogen；批號：4472920)；改良Masson三色染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司；批號：20180906)；Mouse TGF-β1 ELISA kit(達科為生物技術有限公司；批號：I217102)；Mouse BRP-39 ELISA kit(武漢華美生物工程有限公司；批號：I11034872)；Mouse IL-17 ELISA kit(武漢華美生物工程有限公司；批號：G19034871)；Mouse IL-13 ELISA kit(武漢華美生物工程有限公司；批號：I11034870)。

1.2.2 主要儀器 Sorvall Legend Mircro 17臺式離心機(美國Thermo Fisher Scientific公司)；Sorvall ST 16R 冷凍離心機(美國Thermo Fisher Scientific公司)；超低溫冷凍冰箱(美國Thermo Fisher Scientific公司)；恒溫二氧化碳細胞培養箱(德國Binder公司)；RM2135石蠟切片機(德國LEICA公司)；1150H石蠟包埋機(德國LEICA公司)；Asp-300自動脫水機(德國LEICA公司)；NanoDropTMLite分光光度計(美國Thermo Fisher Scientific公司)；Applied Biosystems?StepOneTMReal-Time PCR Systems(美國Thermo Fisher Scientific公司)；EPS 300電泳儀(美國BIO-RAD公司)；2500凝膠成像儀(美國BIO-RAD公司)；HWS-24電熱恒溫水浴槽(上海一恒科學儀器有限公司)。

1.3 TGF-β1重組腺病毒載體構建

根據目的基因序列，分別進行全基因合成，并插入腺病毒表達骨架質粒載體中，完成腺病毒過表達質粒構建。將3～5×106個AD293細胞傳代接種至100 mm細胞培養皿中，置于37℃ 5% CO2培養箱中，培養16～24小時，腺病毒包裝系統轉染、收集、濃縮。最后利用構建完成的基因過表達腺病毒質粒、AD293細胞以及腺病毒包裝試劑盒，進行腺病毒包裝。

1.4 動物分組與造模

1.4.1 實驗動物分組 按照隨機數字表將40只小鼠隨機分為4組，即空白組、空載體組、模型組、銀甘湯組，每組10只。銀甘湯組予銀甘湯6.007 g/(kg·d)灌胃；空白組、空載體組及模型組予生理鹽水10 mL/(kg·d)灌胃。各組于造模次日開始連續灌胃28天，銀甘湯組小鼠灌胃劑量與人體折算倍數為9.01。

1.4.2 模型制備 異氟烷∶丙二醇體積比3∶2配置麻醉用藥，將1 mL上述麻醉藥物滴入自制麻醉裝置中，然后將小鼠放入其中，當小鼠呈現深而慢的呼吸狀態時，將其上牙齒迅速懸掛于預置懸吊線，用鑷子將小鼠舌頭拽出，向模型組、銀甘湯組小鼠氣管內快速滴入50 μL AdTGF-β1(5.0×108PFU)，空載體組小鼠氣管中滴入50 μL AdEGFP(5.0×108PFU)，空白組小鼠氣管中滴入等體積的PBS，嗆入氣管后直立旋轉小鼠數秒，放回鼠籠，待自然蘇醒。造模當天記為0天。

1.5 樣本采集

干預第28天結束后，異氟烷麻醉，摘眼球取血，靜置2小時，4℃ 3000 rpm離心15分鐘，收集血清，-20℃保存，用于ELISA檢測。取血之后處死，剪取左肺浸泡于4%多聚甲醛，用于病理形態學檢測；右肺放入液氮中速凍，轉移至-80℃用于RT-qPCR檢測。

1.6 肺組織形態學檢測

取4%多聚甲醛固定的左肺組織常規脫水、石蠟包埋及切片，行HE染色、Masson染色。顯微鏡下觀察分析各組小鼠纖維化程度。

1.7 RT-qPCR檢測肺組織TGF-β1、BRP-39、IL-17基因表達水平

提取小鼠肺組織RNA，測定總RNA含量，電泳檢測RNA完整性。反轉錄按照以下體系建立反應體系(RNA均取200 ng，補水到10 μL)：RNA 200 ng(10 μL)，Oligo-dT 1 μL，Random 1 μL。上述反應體系混勻，65℃保溫5分鐘，結束后置于冰上。在上述反應體系中加入下列反應液：dNTP(10 μM)1 μL，0.1M DTT 1 μL，5×Buffer 4μL，RT酶 1 μL，混勻后置于42℃水浴60分鐘，取出后置于85℃反應10分鐘，滅活逆轉錄酶。反應結束后置于-20℃待用。每個樣本分別用待檢測基因和內參基因引擴增，每個反應做3個重復，按照以下體系建立擴增體系(20 μL)：cDNA 2 μL，PCR mix 10 μL，primer F 1 μL，primer R 1 μL，dd H2O 6 μL，于熒光定量PCR儀上，按照以下條件反應：預變性95℃ 5分鐘1個循環；變性95℃10秒，退火58℃ 20秒，延伸72℃ 20秒，三者共40循環；熔解曲線 95℃ 15秒，60℃ 60秒，95℃ 15秒，1個循環。基因引物序列見表1。每個樣本檢測3次，讀取Ct值，采用以下公式進行計算相對表達量(RQ)∶RQ=2-(Ctq-Ctab)(Ctq=待測組目的基因平均Ct值-待測組內參基因平均Ct值；Ctab=對照組目的基因平均Ct值-對照組內參基因平均Ct值)。

表1 引物信息

1.8 ELISA檢測血清TGF-β1含量及BRP-39、IL-17、IL-13表達情況

按試劑盒說明書進行實驗；根據標準品濃度，應用Excel軟件繪制標準曲線，R2>0.999為擬合較好，根據曲線的公式計算待測樣品濃度。

1.9 統計學處理

2 結果

2.1 HE染色

空白組和空載體組小鼠肺組織結構正常，肺泡壁完整，未見明顯肺泡融合，未見炎癥細胞浸潤。模型組小鼠肺組織可見肺泡間隔增寬，肺泡塌陷甚至閉合，大部分肺組織可見實變，間質散在較多炎癥細胞。銀甘湯組實變區占比減少，肺泡結構得到改善，炎癥細胞明顯減少。見圖1。

注：A.空白組;B.空載體組;C.模型組;D.銀甘湯組；標尺=100 μm。

2.2 Masson染色

空白組和空載體組小鼠肺組織除在氣道和血管周圍外，僅見少量藍色膠原纖維增生，肺泡間隔未增寬。模型組小鼠肺組織片狀實變區及增厚的肺泡間隔均可見大量的藍色膠原纖維沉積。銀甘湯組小鼠肺組織膠原纖維增生程度較模型組減輕。見圖2。

注：A 空白組、B 空載體組、C 模型組、D 銀甘湯組；標尺=100 μm。

2.3 各組小鼠肺組織和血清TGF-β1含量情況

采用RT-qPCR檢測各組小鼠肺組織中TGF-β1 mRNA水平，空載體組與空白組比較，指標無統計學意義(P>0.05)；模型組TGF-β1 mRNA水平顯著高于空白組及空載體組，差異具有統計學意義(P<0.01)；與模型組比較，銀甘湯組TGF-β1 mRNA水平顯著降低(P<0.01)。見表2。

采用ELISA法檢測各組小鼠血清中TGF-β1含量，空載體組與空白組比較，指標無統計學意義(P>0.05)；模型組TGF-β1 含量顯著高于空白組及空載體組，差異具有統計學意義(P<0.01)；與模型組比較，銀甘湯組TGF-β1含量顯著降低(P<0.01)。見表2。

表2 各組TGF-β1重組腺病毒載體誘導肺纖維化小鼠TGF-β1含量情況

2.4 各組小鼠肺組織BRP-39、IL-17 mRNA表達情況

模型組BRP-39 mRNA、IL-17 mRNA水平明顯高于其他組，與空白組和空載體組比較，BRP-39 mRNA水平無統計學差異(P>0.05)，IL-17 mRNA水平有統計學差異(P<0.01)。銀甘湯組兩者水平較模型組有不同程度的下降，其中，IL-17 mRNA水平的差異具有統計學意義(P<0.01)，而BRP-39 mRNA水平無明顯統計學意義，但具有下調趨勢。見表3。

表3 各組TGF-β1重組腺病毒載體誘導肺纖維化小鼠肺組織BRP-39、IL-17 mRNA水平

2.5 各組小鼠血清BRP-39、IL-17、IL-13表達水平

模型組小鼠血清中BRP-39、IL-17、IL-13水平均有升高，與空載體組比較，BRP-39、IL-17水平有統計學差異(P<0.05)，IL-13水平無統計學差異(P>0.05)。經過銀甘湯治療后，小鼠血清中三種炎癥因子的蛋白表達水平均有下調。與模型組比較，銀甘湯組BRP-39、IL-17水平下調具有統計學意義(P<0.05)，而銀甘湯組IL-13水平雖無明顯統計學差異(P>0.05)，但有下調趨勢。見表4。

表4 各組TGF-β1重組腺病毒載體誘導肺纖維化小鼠血清BRP-39、IL-17、IL-13表達水平

3 結論

目前，制備肺纖維化動物模型的誘導方式多用博來霉素，存在制模時間長等局限性[9]。Sime等[1]研究組以腺病毒為載體將TGF-β1基因轉入大鼠體內，并使其在肺泡上皮中高表達，成功制備了TGF-β1單基因過表達誘發的大鼠肺纖維化動物模型。隨后，李建等[10]的實驗也表明以TGF-β1重組腺病毒誘導是一種可靠的肺纖維化動物模型制備方法，腺病毒誘發的肺纖維化的發病急、炎癥反應強烈、細胞外基質增生迅速等特點與特發性肺纖維化病理過程相似。再者，以TGF-β1作為目的基因，用重組腺病毒載體進行包裝導致的肺纖維化，直接針對TGF-β1信號傳導通路，靶點明確。

本研究所用銀甘湯由金銀花和生甘草按3∶1比例配伍而成，均是肺痹湯的主要組成部分。方中金銀花辛涼解表，清熱解毒；生甘草清熱解毒，祛痰止咳，調和諸藥。兩藥配合，藥理研究表明能起到抗炎、抗纖維化、調節免疫的作用。

本次實驗從病理形態學結果來看，模型組小鼠炎性細胞浸潤、肺泡間隔增厚程度以及膠原纖維增生程度都比空白組和空載體組嚴重；而且模型組肺組織中TGF-β1 mRNA的表達及血清中TGF-β1含量均比空白組和空載體組高，且具有統計學意義(P<0.01)，這兩者都提示了本實驗肺纖維化小鼠模型制備的成功。

從病理形態學結果看，銀甘湯組小鼠炎性細胞浸潤、肺泡間隔增厚程度以及膠原纖維增生程度較模型組有所減輕。通過肺組織勻漿RT-qPCR和血清ELISA，發現銀甘湯可以降低肺組織中BRP-39 mRNA、IL-17 mRNA表達及血清中BRP-39、IL-17、IL-13表達水平。

此次研究表明，使用TGF-β1重組腺病毒進行氣管滴注，能夠較好地制備肺纖維化動物模型。TGF-β1可以促進BRP-39、IL-17、IL-13等炎性因子的分泌，而銀甘湯可以減輕AdTGF-β1誘導C57BL/6小鼠的炎性反應，從而在一定程度上緩解TGF-β1重組腺病毒誘導的小鼠肺纖維化。本次研究僅針對造模后第28天的結果，對于炎性因子的動態變化缺少觀察，今后可在造模后第3、7、14、28天分階段取材，深入研究AdTGF-β1誘導的小鼠肺纖維化模型，使其更好地應用于肺纖維化研究領域。