枸杞木虱ORCO 基因及其編碼蛋白的生物信息學分析

祁全梅，李秋榮，郭青云

（青海大學農林科學院/農業部西寧作物有害生物科學觀測實驗站/ 青海省農業有害生物綜合治理重點實驗室，青海 西寧810016）

枸杞木虱（Paratrioza sinica Yang & Li）又稱豬嘴蜜、黃疸，屬半翅目（Hemiptera） 木虱科（Psylloidae）[1，2]，主要分布在寧夏、青海、甘肅、新疆、陜西和內蒙古等地區[3]。其成蟲如小蟬，活動范圍廣，全體黃褐色至黑褐色，具橙黃色斑紋，腹部背面近基部具1 條蠟白橫帶；若蟲形似介殼蟲，扁平，固著于葉面；卵橢圓形，具長柄，橙黃色[4～6]。枸杞木虱、枸杞蚜蟲和枸杞癭螨是為害枸杞的三大害蟲[7～9]，枸杞木虱成蟲和若蟲通過刺吸葉片組織吸食汁液，造成樹勢衰弱和早期落葉，導致果實產量和品質降低，經濟收入減少，且枸杞木虱可攜帶枸杞癭螨越冬[10，11]。目前，枸杞木虱防治以化學藥劑為主，而長期使用化學農藥導致枸杞木虱產生了一定的抗藥性，這不僅會造成環境污染，殺傷天敵，還會造成產品農藥殘留超標[12～14]。因此，研究與開發綠色、高效藥劑或方法對枸杞木虱防治十分重要。

昆蟲的嗅覺是行為感覺的一種重要信號輸入來源，是其生存和繁衍的關鍵[15～18]。昆蟲氣味受體最初從黑腹果蠅中鑒定出來[19～21]，分為傳統型氣味受體（olfactory receptor，OR） 和非典型氣味受體（olfactory receptor coreceptor，ORCO）[22，23]。OR 分布在嗅覺感覺神經元樹突的膜表面，氣味分子或氣味分子與OBPs 的復合物通過激活對應的OR 傳遞嗅覺信號[24]，使昆蟲產生反應；ORCO 介導的氣味分子與嗅覺神經元的特異性結合是昆蟲重要的嗅覺識別基礎[25，26]，ORCO 與OR 相互作用形成的異源二聚體對昆蟲嗅覺具有重要作用[27]。不同昆蟲間的OR 多樣性豐富，同源性低；而ORCO 具有高度保守性[28]。當ORCO 被干擾表達時，昆蟲將顯示出嗅覺缺陷，表明ORCO 有可能成為一個破壞嗅覺信號的分子靶標，對嗅覺的干擾或破壞會影響昆蟲對氣味和性信息素的反應，繼而影響到昆蟲取食以及交配和產卵等行為活動[29～31]。

深入探索與昆蟲嗅覺相關的基因有助于昆蟲嗅覺機制的研究，可為害蟲的預防和治理提供新的方法[32，33]。但截至目前，有關枸杞木虱氣味受體基因的研究尚未見報道。本研究通過對枸杞木虱ORCO 基因進行生物信息學分析，旨在為進一步研究驗證該基因及其編碼蛋白在枸杞木虱識別寄主以及尋找異性和產卵場所等過程中所發揮的作用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 序列來源

分析枸杞木虱成蟲的轉錄組測序數據，篩選得到枸杞木虱ORCO 基因序列。

1.2 研究方法

利用分析軟件（表1），對枸杞木虱ORCO 基因及其編碼蛋白進行理化性質、序列特性、結構預測、進化關系等生物信息學分析。

2 結果與分析

2.1 枸杞木虱ORCO 蛋白理化性質分析

枸杞木虱ORCO 蛋白理化性質分析結果顯示，該基因編碼450 個氨基酸，分子質量約51.25 KD，等電點為6.32。組成枸杞木虱ORCO 基因編碼蛋白的氨基酸有20 種，以亮氨酸含量（10.4%）最高，編碼蛋白不穩定系數為37.64，屬穩定蛋白；ORCO 蛋白有37 個Arg+Lys 和33 個Asp+Lys；脂肪系數為96.76，總平均親水指數為0.254，為脂溶性蛋白。

2.2 枸杞木虱ORCO 蛋白亞細胞定位分析

枸杞木虱ORCO 蛋白亞細胞定位結果（表2）顯示，枸杞木虱ORCO 蛋白位于其他細胞器，而不在細胞核。

表2 枸杞木虱ORCO 蛋白亞細胞定位結果Table 2 Subcellular localization results of ORCO protein in P. sinica

2.3 枸杞木虱ORCO 蛋白跨膜區預測

枸杞木虱ORCO 蛋白跨膜區預測分析結果（圖1）顯示，該蛋白有7 個跨膜結構，分別在第34～56 位、第 62～84 位、第 124 ～146 位、第 195 ～217 位、第322～344 位、第 354～376 位和第 424～446 位處，其中第 1～33 位、第 85～123 位、第 218～321 位和第 377～423 位氨基酸在膜內，第 57～61 位、第 147～194 位、第 345～353 位和第 447～450 位氨基酸在膜外。

圖1 枸杞木虱ORCO 蛋白跨膜結構Fig.1 Transmembranc structure of ORCO protein in P. sinica

2.4 枸杞木虱ORCO 蛋白信號肽預測

信號肽預測主要是由S 值大小判斷，S 值＞0.5 表示該蛋白屬分泌蛋白，反之則不屬分泌蛋白[34]。通過SignalP 5.0 對枸杞木虱ORCO 蛋白信號肽進行預測，結果顯示，其S 值為0.001 3（圖2），故該蛋白沒有信號肽。

圖2 枸杞木虱ORCO 蛋白信號肽預測Fig.2 Signal peptide prediction of ORCO protein in P. sinica

2.5 枸杞木虱ORCO 蛋白磷酸化位點分析

枸杞木虱ORCO 編碼蛋白潛在磷酸化位點分析結果（圖3）顯示，6 個蘇氨酸、37 個絲氨酸和7 個酪氨酸是該蛋白潛在的磷酸化位點。

2.6 枸杞木虱ORCO 蛋白保守結構域分析

Smart 分析結果（圖4）顯示，枸杞木虱ORCO 蛋白在第59～440 位處有1 個Pfam：7tm_6 結構域，其E值為 1.7e-88；在第 268～450 位處有 1 個 Pfam：7tm_7 結構域，其E 值為6.5e-9。

圖3 枸杞木虱ORCO 潛在磷酸化位點Fig.3 Potential phosphorylation sites of ORCO protein in P. sinica

圖4 枸杞木虱ORCO 蛋白保守結構域Fig.4 Conservative domains of ORCO protein in P. sinica

2.7 枸杞木虱ORCO 蛋白親疏水性分析

枸杞木虱ORCO 蛋白親疏水性分析結果（圖5）顯示，該基因編碼蛋白的最大疏水性值為3.322（第52 位），最小疏水性值為-2.856（第157 位），平均疏水性為0.254。表明ORCO 蛋白屬疏水性蛋白。

圖5 枸杞木虱ORCO 蛋白親疏水性Fig.5 Hydrophilicity and hydrophobicity of ORCO protein in P. sinica

2.8 枸杞木虱ORCO 蛋白二級結構預測

枸杞木虱ORCO 蛋白二級結構預測結果（圖6～8）顯示，枸杞木虱ORCO 蛋白二級結構中有243 個α 螺旋、80 個直鏈延伸、17 個β 轉角和110 個無規則卷曲，分別占54.00%、17.78%、3.78%、24.44%。表明枸杞木虱ORCO 蛋白二級結構以α 螺旋為主。

圖6 枸杞木虱ORCO 蛋白二級結構序列Fig.6 Secondary structure sequence of ORCO protein in P. sinica

2.9 枸杞木虱ORCO 蛋白三級結構預測

在線分析預測枸杞木虱ORCO 蛋白的三級結構，結果（圖9）顯示，枸杞木虱ORCO 蛋白的三級結構主要由α 螺旋和無規則卷曲纏繞折疊形成。

2.10 枸杞木虱ORCO 進化樹分析

圖7 枸杞木虱ORCO 蛋白二級結構預測Fig.7 The secondary structure prediction of ORCO Protein in P. sinica

圖8 枸杞木虱ORCO 蛋白二級結構峰值變化圖Fig.8 Secondary structure peak change graph of ORCO protein in P. sinica

圖9 枸杞木虱ORCO 蛋白三級結構Fig.9 Tertiary structure of ORCO protein in P. sinica

從枸杞木虱非典型氣味受體進化樹（圖10）可以看出，昆蟲的ORCO 基因以目為分類單元進行聚類，近緣種只檢索到黃偽毛蚜（Sipha flava）、桃蚜（Myzus persicae）、豌豆蚜（Acyrthosiphon pisum）、棉蚜（Aphis gossypii）、玉米蚜 （Hopalosiphum maidis） 和高粱蚜（Melanaphis sacchari）等半翅目蚜科昆蟲，枸杞木虱的ORCO 與這些蚜科昆蟲聚為一支；而鞘翅目和鱗翅目昆蟲的ORCO 則形成獨立的分支。

3 結論與討論

本研究結果表明，枸杞木虱ORCO 編碼450 個氨基酸，分子質量約51.25 KD，等電點為6.32，屬于穩定蛋白，亞細胞定位預測枸杞木虱ORCO 蛋白主要分布在其他細胞器而不是細胞核，這與向侯君等[30]對斑翅果蠅ORCO 基因的分析結果相似；枸杞木虱ORCO基因是具有7 個跨膜結構域，N 末端在胞內、C 末端在胞外的的G 蛋白偶聯受體，這與雙委夜蛾、麥蛾、懸鈴木方翅網蝽等昆蟲的 ORCO 基因特性[27，34～39]相同。

通過基因S 值對枸杞木虱ORCO 蛋白信號肽進行預測，該蛋白基因S 值（0.001 3）＜0.5，不屬分泌蛋白。通過蛋白保守結構域分析可知，枸杞木虱ORCO在第6 與第7 跨膜區、第7 跨膜區具高度保守結構域。親疏水性分析發現，該蟲ORCO 基因編碼蛋白屬于疏水性蛋白。枸杞木虱ORCO 蛋白的二級結構以α螺旋為主，且無規則卷曲和直鏈延伸也占有一定比例；三級結構主要由α 螺旋和無則規卷曲纏繞折疊形成，ORCO 基因在結構上的高度保守性說明其在昆蟲的一系列生命活動中有著至關重要的作用。

本研究利用生物信息學軟件對柴達木地區枸杞的主要害蟲枸杞木虱ORCO 基因及其編碼蛋白的理化性質、序列特性、結構預測和進化關系等進行了系統分析，為研究枸杞木虱新的防治靶標奠定了理論基礎，而對枸杞木虱ORCO 基因的克隆、蛋白表達和功能驗證有待下一步研究。

圖9 枸杞木虱與其它昆蟲ORCO 的進化樹Fig.9 Phylogenetic tree of ORCO protein in P. sinica with other insects