MTHFR 與ABCB1 基因多態性對血液系統惡性腫瘤患者大劑量甲氨蝶呤排泄延遲和肝腎毒性的影響*

馬 樂 ，韓 佳 ，呂冬梅 △

（1. 徐州醫科大學，江蘇 徐州 221009； 2. 徐州醫科大學附屬醫院藥學部，江蘇 徐州 221002）

甲氨蝶呤（MTX）屬葉酸拮抗劑，大劑量甲氨蝶呤（HD-MTX）能顯著提高腫瘤患者的長期生存率［1-2］，目前廣泛用于多種血液系統惡性腫瘤［如急性淋巴細胞白血病（ALL）和骨肉瘤］的治療。患者行 HD-MTX 治療后常會出現MTX 排泄延遲現象，并引發肝腎功能損傷等毒副反應，且個體差異較大。亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）和三磷酸腺苷（ATP）結合盒B 亞家族成員1轉運蛋白（ABCB1）的基因多態性與MTX 排泄延遲及肝腎毒性可能相關，但已有研究的結果不一致［3-5］。本研究中選取徐州醫科大學附屬醫院收治的使用HD-MTX化學治療（簡稱化療）的血液系統惡性腫瘤成年患者131 例，通過監測用藥后48 h 體內MTX 的血藥濃度及用藥前后的肝腎功能，研究MTHFR C677T（rs1801133）和 ABCB1 C3435T（rs1045642）2 個位點基因多態性對MTX 排泄延遲及肝腎毒性的影響，為HD-MTX 個體化用藥提供更多依據。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象

收集徐州醫科大學附屬醫院2019 年4 月至2020 年5 月收治的131 例血液系統惡性腫瘤成年患者的基本信息、給藥劑量、合并用藥情況等。其中男67 例，女64 例；平均年齡（54.31 ±14.01）歲。納入標準：入院后確診為 ALL、中樞神經系統淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤等血液系統惡性腫瘤；采用大劑量（＞500 mg／m2）甲氨蝶呤注射液（輝瑞制藥有限公司，進口藥品注冊證號H20140205，規格為每支10 mL ∶1 g）治療，且化療過程中未出現嚴重過敏反應；用藥過程中及用藥后24 h 內未使用非甾體類抗炎藥、復方磺胺甲唑及質子泵抑制劑等影響MTX 血藥濃度的藥物；使用HD-MTX 前12 h 及用藥后給予充分水化及堿化尿液；化療前查血常規、肝腎功能等實驗室指標均正常。

1.2 方法

1.2.1 血藥濃度測定

采集患者給予MTX 后48 h 時的外周靜脈血，加入乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管，離心，取上清液，使用Viva-E 型快速血藥濃度監測儀（德國Siemens 公司）測定血藥濃度并記錄，以超過 1 μmol／L 為排泄延遲［6-7］。

1.2.2 基因型檢測

使用核酸提取及純化試劑（上海百傲科技有限公司）提取DNA，置-20 ℃冰箱內貯存。使用聚合酶鏈反應（PCR）擴增試劑盒（上海生工生物工程有限公司），配制50 μL 擴增體系，置 PCR 儀（美國 ABI 公司）內完成擴增。

引物（由上海生工合成）序列：MTHFR C677T（rs1801133），上游 5′-GGTCAGAAGCATATCAGTCATG-3′，下游：5′-AGCGAACTCAGCACTCCAC-3′。

ABCB1 C3435T（rs1045642）：上 游 5′-TTCAGCTGCTTGATGGCAAA-3′ ，下 游 5′-AGGCAGTGACTCGATGAAGG-3′。

PCR 擴增程序：MTHFR C677T，95 ℃預變性 5 min。95 ℃變性 30 s；58 ℃ 退火 30 s；72 ℃延伸 40 s；共 30 個循環。72 ℃延伸 7 min 結束，4 ℃ 保存。ABCB1 C3435T，95 ℃預變性 5 min。95 ℃變性 30 s；57.1 ℃退火 30 s；72 ℃延伸 30 s；共 30 個循環。72 ℃延伸 5 min 結束，4 ℃ 保存。

檢測：擴增結束后用2%瓊脂糖凝膠電泳對擴增產物進行特異性驗證。剩余PCR 產物原液送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，測序結果以CHOMAS軟件與MTHFR 和ABCB1 基因SNP 位點的標準序列比照，以確定基因型。

1.2.3 肝腎功能評價

記錄患者使用HD-MTX 治療前后的肝腎功能，肝臟毒性反應評價參照美國國立研究所常規毒性判定標準，其中肝功能損害主要表現為丙氨酸氨基轉移酶水平升高；腎功能損害的判定為血肌酐值超過基礎值的1.5 倍。

1.3 統計學處理

采用 Excel 2019 和 SPSS 25.0 統計學軟件分析。計數資料以率（%）表示，計數資料比較及基因型分布與Hardy-Weinberg 平衡定律相符情況分析采用 χ2檢驗。P ＜ 0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 基因型分布

采用 PCR-直接測序法測定 MTHFR 677 與ABCB1 3435 位點基因型，結果見圖1 和圖2（箭頭所指為變異堿基 ）。131 例患者中，MTHFR 677 CC 型 52 例（39.69%），CT 型 53 例（40.46%），TT 型 26 例（19.85%），C 和T 的等位基因分布頻率分別為59.92%和40.08%。ABCB13435CC 型 53 例（40.46%），CT 型 45 例（34.35%），TT 型 33 例（25.19% ），C 和 T 的等位基因分布頻率分別為 57.63%和 42.37%。且 2 個位點均以 CC 型為野生純合型，CT 型為突變雜合型，TT 型為突變純合型。經 χ2檢驗，各基因多態位點基因型分布均符合Hardy-Weinberg 定律（P ＞ 0.05），入選樣本具有群體代表性。

2.2 基因多態性與MTX 排泄延遲的關系

圖1 MTHFR 677 位點基因分型波形圖Fig.1 Genotyping waveform figure of MTHFR 677 site

圖2 ABCB1 3435 位點分型波形圖Fig.2 Genotyping waveform figure of ABCB1 3435 site

131 例患者中，出現 MTX 排泄延遲 70 例（53.44% ）。MTHFR 677 位點及 ABCB1 3435 位點 CT 型攜帶者和TT 型攜帶者發生排泄延遲的比例均高于CC 型攜帶者，但差異均無統計學意義（P ＞0.05）。詳見表 1。

表1 基因多態性與甲氨蝶呤排泄延遲的相關性［例（%）］Tab.1 The correlation between gene polymorphisms and MTX-elimination delay［case（%）］

2.3 基因多態性與MTX 肝腎毒性的關系

131 例患者中，發生肝功能異常 23 例（17.56% ），腎功能異常10 例（7.63%）。由于發生肝腎損傷的人數較少，將患者按是否攜帶T 等位基因分為CC 型（野生型）組和（CT+TT）型（突變型）組進行分析。本研究中，MTHFR 677 位點（CT+TT）型攜帶者肝腎功能損傷發生率均較 CC 型高，但差異無統計學意義（P ＞ 0.05），結果見表 2；ABCB1 3435 位點（CT+TT）型攜帶者肝功能損傷發生率明顯高于 CC 型（P ＜0.05），兩者腎功能損傷發生率比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）。詳見表 2和表3。

表2 MTHFR 677基因多態性與甲氨蝶呤肝腎損傷的相關性［例（%）］Tab.2 The correlation between gene polymorphism of MTHFR 677 and MTX-induced liver and kidney injury［case（%）］

表3 ABCB1 3435 基因多態性與甲氨蝶呤肝腎損傷的相關性［例（%）］Tab.3 The correlation between ABCB1 3435 gene polymorphism and MTX-induced liver and kidney injury［case（%）］

3 討論

MTHFR 是參與DNA 合成和甲基化的重要限速酶，催化體內的5，10-亞甲基四氫葉酸還原為5-甲基四氫葉酸，影響核酸代謝過程。MTX 主要通過影響核酸代謝發揮細胞毒作用，藥效與5，10-亞甲基四氫葉酸的濃度呈正相關。ABCB1 主要位于細胞膜上，可以通過機體內ATP 水解釋放的能量以主動轉運形式將藥物泵出細胞，由它編碼的 P-糖蛋白能影響藥物在機體內的吸收、分布和排泄。

李靜等［8］研究發現，攜帶 MTHFR 677 位點（CT+TT）型ALL 患者用藥后48h 時的血藥濃度明顯高于CC 型（P ＜ 0.05）。楊麗華等［9］研究 40 例 ALL 患兒的結果顯示，攜帶（CT+TT）型患兒接受HD-MTX 治療后48 h時的 MTX 血藥濃度明顯高于 CC 型（P ＝ 0.006）。但以上研究并未對患者（兒）MTHFR 677 基因多態性與MTX用藥后48 h 排泄延遲的相關性進行討論。李菲等［10］的研究結果表明，攜帶MTHFR 677 位點（CT+TT）型不同患兒的 MTX 排泄延遲發生率相當（P ＞ 0.05），本研究結果與之一致。近年來，對ABCB1 3435 位點（CT+TT）型與MTX 在體內代謝排泄相關性的研究結果也不盡相同。KIM 等［11］研究 ABCB1 3435（CT+CC）型與 MTX 清除率的關聯性時發現，CC 型和CT 型攜帶者清除率明顯大于 TT 型（P ＜ 0.05）。SUTHANDIRAM 等［12］測定了亞洲成人ALL 與非霍奇金淋巴瘤患者使用HD-MTX化療后48 h 的血藥濃度與ABCB1 3435 位點（CT+TT）型基因多態性。兩者結果均與本研究一致。GREGERS等［13］對丹麥急性白血病患兒的研究顯示，ABCB1 3435位點（CT+TT 型）基因多態性對MTX 的藥物代謝動力學無明顯影響，本研究中亦未發現該位點多態性與MTX 排泄延遲有關。

鄭苗苗等［14］對 52 例 ALL 患兒進行了 MTHFR 677位點（CT+TT）型基因型檢測，按國立癌癥研究所常規毒性判定標準對患者化療后不良反應進行統一評價，結果顯示，各基因型發生HD-MTX 相關毒副反應的差異無統計學意義（P ＞ 0.05）。伍艷鵬等［15］篩選了 ALL 患兒 73 例，PCR 擴增后測序鑒定 MTHFR 677 位點（CT+TT）基因型，顯示該位點與MTX 引發的不良反應無顯著相關性。陳先睿等［16］研究發現，閩南地區 ALL 患兒MTHFR 677 位點（CT+TT）型不同基因組的 MTX 化療肝腎功能損害發生率相當（P ＞ 0.05）。朱忱等［17］納入9 篇文獻進行Meta 分析，結果與上述研究結果相同。本研究結果顯示，MTHFR C677 位點（CT+TT）型基因與肝腎功能損傷的發生率無明顯相關性，ABCB1 3435位點（CT+TT）型攜帶者肝功能損傷的發生率明顯較CC 型 高 （P ＜ 0.05）。CORNET 等［18］的 研 究 顯 示 ，當ABCB1 3435 位點發生C ＞T 突變后可產生不耐熱的酶變體，導致用藥后體內同型半胱氨酸水平迅速上升，造成肝功能損傷。陸愛東等［19］報道，ALL 患兒的 ABCB1 3435 位點（CT+TT）型在使用HD-MTX 后肝功能損傷發生率高于 CC 型。朱影等［20］研究發現，ABCB1 3435 位點TT 型攜帶者發生肝功能損傷的風險較高。劉爽等［21］納入12 篇相關文獻的Meta 分析結論與上述資料相同。本研究結果與陸愛東等［19］的研究結果一致。

綜上所述，ABCB1 3435 位點（CT+TT）型基因多態性與血液系統腫瘤患者使用HD-MTX 后的肝功能損傷相關，后續將進一步研究MTX 代謝排泄相關酶基因多態性與MTX 排泄延遲、毒副作用相關性的機制，為HD-MTX 個體化用藥提供更多依據。