高效液相色譜波長切換法同時測定筋骨草中5 種成分含量*

王 淼，管 敏

（南京中醫藥大學附屬醫院，江蘇 南京 210029）

筋骨草始載于清代《本草綱目拾遺》，為唇形科植物筋骨草 Ajuga decumbens Thunb. 的干燥全草，又名白毛夏枯草，具有清熱涼血、解毒消腫、止咳、化痰、平喘功效［1-3］。其植物主要分布于浙江、江蘇、福建等秦嶺以南各省區，筋骨草、金瘡小草和紫背金盤為同屬近緣種植物，外觀極相似［4-5］。筋骨草主要成分為環烯醚萜苷類、黃酮類，具有抗菌、消炎、止咳平喘等作用［6-8］。2015 年版《中國藥典（一部）》筋骨草項下僅以乙酰哈巴苷的含量作為質量控制指標［9］，乙酰哈巴苷并非筋骨草特有成分，金瘡小草和紫背金盤中也能檢測出乙酰哈巴苷［4］，故現行質量標準難以全面控制筋骨草藥材的質量。本研究中采用高效液相色譜（HPLC）法同時測定筋骨草中哈巴苷、乙酰哈巴苷、木犀草素、芹菜素、杯莧甾酮的含量，為筋骨草藥材及其制劑的質量控制提供參考。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

AR2140 型電子天平（美國 Ohaus 集團，精度為0.1 mg）；BP211D 型電子天平（德國 Sartorius 公司，精度為 0.01 mg）；SK6200H 型超聲清洗儀（上海科導超聲儀器有限公司）；1260S 型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）。

1.2 試藥

哈巴苷對照品（批號為111729-201204），乙酰哈巴苷對照品（批號為111925-201001），木犀草素對照品（批號為111520-201605），芹菜素對照品（批號為111901-201102），杯莧甾酮對照品（批號為111804-201705），均購于中國食品藥品檢定研究院，含量均不低于98%；甲醇、乙腈均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水；筋骨草藥材飲片（安徽井泉集團中藥飲片有限公司，批號分別為 20160101，20180401，20180501，20180701，20180901）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.4%磷酸溶液（B），梯度洗脫（洗脫程序見表 1）；流速：1.0 mL ／min；檢測波長：202 nm（哈巴苷、乙酰哈巴苷）、245 nm（杯莧甾酮、木犀草素、芹菜素）；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

表1 梯度洗脫程序及波長設置Tab.1 Gradient elution programs and wavelength setting

2.2 溶液制備

取木犀草素對照品10.80 mg、芹菜素對照品9.42 mg和杯莧甾酮對照品33.61 mg，精密稱定，加甲醇溶解，超聲（功率200 W，頻率40 kHz，下同）處理15 min，加甲醇定容至25 mL，作為對照品溶液A；稱取哈巴苷對照品 83.60 mg、乙酰哈巴苷對照品 45.62 mg，精密稱定，加入對照品溶液A 10 mL 及適量甲醇，超聲處理15 min，加甲醇定容至20 mL，制成混合對照品母液；量取5 mL，置 50 mL 容量瓶中，制成每 1 mL 含哈巴苷 418.0 μg、乙酰哈巴苷 228.1μg、木犀草素21.6μg、芹菜素18.84μg、杯莧甾酮67.22 μg 的混合對照品溶液。取筋骨草藥材飲片粉末約1 g，精密稱定，加入30 mL 甲醇，加熱回流1 h，放冷，濾過，殘渣用甲醇洗滌3 次，與濾液并入50 mL 容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，經 0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續濾液，即得供試品溶液。以甲醇作為陰性對照品溶液。

2.3 方法學考察

系統適用性試驗：取2.2 項下3 種溶液各適量，按2.1 項下色譜條件進樣測定，色譜見圖1。結果5 種成分基線均能分離，各峰分離度良好。

線性關系考察：分別精密量取2.2 項下混合對照品母液 0.2，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0 mL，置 25 mL 容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，制成系列混合對照品溶液。精密量取10 μL，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分質量濃度（X，μg／mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得哈巴苷、乙酰哈巴苷、杯莧甾酮、木犀草素、芹菜素回歸方程分別為 Y1＝3.821 4 X1-1.736 9（R12＝ 0.999 9）、Y2＝ 9.156 4 X2-12.382（R22＝ 0.999 9）、Y3＝ 13.442 X3+4.274 6（R32＝0.999 9）、Y4＝ 84.67 X4-1.137 5（R42＝ 0.999 9）、Y5＝89.22 X5-5.916 4（R52＝0.999 9）。結果表明，哈巴苷、乙酰哈巴苷、杯莧甾酮、木犀草素、芹菜素質量濃度在33.44 ～ 1 672.00 μg ／mL、18.248 0 ～ 912.40 μg ／mL、5.377 6 ～268.88 μg ／mL、1.728 0 ～ 86.40 μg ／mL、1.507 2 ～75.36 μg／mL 范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：取2.2 項下混合對照品溶液適量，按2.1 項下色譜條件連續進樣測定6 次，記錄峰面積。結果哈巴苷、乙酰哈巴苷、杯莧甾酮、木犀草素、芹菜素峰面積的 RSD 分別為 0.64% ，0.25% ，0.44% ，0.35% ，0.29%（n ＝6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取 2.2 項下供試品溶液（批號為20160101）適量，依法制備供試品溶液，分別于室溫下放置 0，2，4，6，12 h 時按 2.1 項下色譜條件進樣測定。結果哈巴苷、乙酰哈巴苷、杯莧甾酮、木犀草素、芹菜素峰面積的 RSD 分別為 0.76% ，0.39% ，3.73% ，1.48% ，2.55% （n ＝ 5），表明供試品溶液在室溫放置 12 h 內基本穩定。

重復性試驗：取樣品（批號為20160101）適量，各6 份，精密稱定，按2.2 項下方法制備供試品溶液，再按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算含量。結果哈巴苷、乙酰哈巴苷、杯莧甾酮、木犀草素、芹菜素含量平均值分別為 0.960%，0.830%，0.040%，0.020%，0.014% ，RSD 分別為 0.80% ，0.58%，2.40% ，2.62%，4.68%（n ＝6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品（批號20160101）適量，共 6 份，每份約 0.5 g，分別加入一定質量濃度的哈巴苷、乙酰哈巴苷、杯莧甾酮、木犀草素、芹菜素對照品溶液，按2.2 項下方法制備供試品溶液，再按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算回收率。結果見表2。

2.4 樣品含量測定

取5 批樣品各適量，分別按2.2 項下方法制備供試品溶液，再按2.1 項下色譜條件進樣測定，平行測定3 次，記錄峰面積，并計算樣品含量。結果見表3。

3 討論

筋骨草中環烯醚萜苷類、黃酮類具有抗菌、消炎、止咳平喘等作用，是發揮功效的主要成分［7-8］。環烯醚萜苷類中哈巴苷和乙酰哈巴苷是含量最高的2 種成分，乙酰哈巴苷也是 2015 年版《中國藥典（一部）》［9］中筋骨草項下規定的質量控制指標，本課題組前期研究也證實了筋骨草中哈巴苷和乙酰哈巴苷的抗菌活性。木犀草素、芹菜素是黃酮類中含量較高且有明顯保肝利膽和止咳平喘作用的成分［10-11］，杯莧甾酮也具有抗炎、抗菌活性［12］。因此，本研究中以哈巴苷、乙酰哈巴苷、木犀草素、芹菜素和杯莧甾酮作為筋骨草的質量控制指標。

乙腈的洗脫能力優于甲醇，流動相中加入少量的酸性溶液可有效改善峰形。預試驗中先采用0.4%甲酸溶液，但其在202 nm 波長處有吸收，基線不穩，因此選擇乙腈-0.4%磷酸溶液為流動相，基線平穩，各成分峰形較好。哈巴苷和乙酰哈巴苷的檢測波長為202 nm，木犀草素、芹菜素和杯莧甾酮在245 nm 波長處有較大吸收，因此在0 ～22 min 時，設置檢測波長為202 nm，22 min后切換波長為245 nm，通過波長切換方法實現多種不同結構成分的同時測定，大大提高了檢測效率。

預試驗中分別比較了乙醇、甲醇、50%甲醇為提取溶劑時的提取效果，用乙醇提取時筋骨草藥材飲片中各成分含量均較低；用50%甲醇提取時哈巴苷和乙酰哈巴苷提取率較高，芹菜素、木犀草素和杯莧甾酮提取率低；用甲醇提取時5 種成分均有相對較高的提取率。加熱回流1 h，各成分的提取率顯著高于超聲提取。

表2 加樣回收試驗結果（n ＝6）Tab.2 Results of recovery tests（n ＝ 6）

表3 樣品中5 種成分含量測定結果（%，n ＝3）Tab.3 Results of content determination of five constituents in the samples（%，n ＝3）

不同批次筋骨草藥材飲片中杯莧甾酮的含量差異較大，有的批次未能檢測出杯莧甾酮，可能與杯莧甾酮的穩定性有關。其應在低溫（0 ～10 ℃）下避光保存，如長時間暴露在空氣中，含量會降低。因此，筋骨草藥材在加工、炮制、儲存過程中，應注意杯莧甾酮的不穩定性。

中藥成分復雜，與療效相關的多指標控制是中藥質量管理的必然發展趨勢［13］。本研究中在2015 年版《中國藥典（一部）》筋骨草質量控制基礎上，建立了HPLC波長切換法同時測定筋骨草中5 種成分的含量，方法高效、簡便，可重復，可為筋骨草藥材及其制劑質量控制提供參考。