黃芪三七合劑質量標準研究*

張仕瑾 ，蘭 楊 ，王婭俐 ，趙茂林 ，郭廷東 ，張 燕 ，唐志立 ，謝席勝

（1. 川北醫學院第二臨床醫學院·四川省南充市中心醫院藥學部·個體化藥物治療南充市重點實驗室，四川 南充 637000； 2. 川北醫學院醫學影像學院，四川 南充 637100 3. 川北醫學院第二臨床醫學院·四川省南充市中心醫院腎內科，四川 南充 637000）

黃芪三七合劑是根據川北醫學院第二臨床醫學院腎內科謝席勝主任醫師臨床驗方開發的院內制劑，由黃芪、三七、當歸、牛膝、昆布、薏苡仁、山藥、甘草等中藥組方，有益氣養血、活血利水、健脾助運之功效，臨床主要用于改善3-4 期慢性腎臟病患者的臨床癥狀，延緩其病情向終末期發展。前期研究發現，黃芪三七復方能降低尿蛋白水平，調節血脂，改善高凝血狀態，調節血清白蛋白水平及免疫狀態，繼而延緩病情進展，提高慢性腎臟病患者的生存質量［1-2］。湯劑煎煮煩瑣，攜帶、儲藏不便，且口感差，患者依從性差。為此，本課題組在不改變原方湯劑的物質基礎上將其開發成合劑，并在前期完成了黃芪三七合劑制備工藝研究。為有效控制其質量，本研究中擬對制劑中黃芪、三七、當歸進行定性鑒別，并對其中有效成分人參皂苷Rg1進行含量測定，以建立該制劑的質量標準。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20AT 型高效液相色譜儀（日本Shimadzu 公司）；MS105DU 型電子分析天平（梅特勒-托利多國際有限公司）；JY10002 型電子分析天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）；TGL-16M 型臺式高速冷凍離心機（濟南鑫貝西生物技術有限公司）；KQ-250V 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；UPH-1V-20T 型超純水制造系統（四川優普超純科技有限公司）。

1.2 試藥

黃芪三七合劑（南充市中心醫院制劑室，批號分別為 0224，0225，0226）；當歸對照藥材（批號為 120927-201617），人參皂苷 Rg1對照品（批號為 110703-201832，含量為 92.4% ），黃芪甲苷對照品（批號為110781-201717，含量為 96.9% ），三七皂苷 R1對照品（批號為 110745-201820，含量為 93.1%），均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 定性鑒別

當歸：取樣品50 mL，乙醚振搖提取2 次，每次40 mL，水相留存備用，合并有機相，水浴蒸干，加甲醇2 mL 溶解固形物，作為供試品溶液。按黃芪三七合劑處方和工藝制備缺當歸的陰性樣品，同法制得缺當歸的陰性對照品溶液。另取當歸對照藥材0.5 g，用20 mL 乙醚超聲（功率250 W，頻率40 kHz）提取10 min，提取液濾過，水浴蒸干，加甲醇1 mL 溶解固形物，作為對照藥材溶液。按 2015 年版《中國藥典（四部）》通則 0502“薄層色譜法”項下方法，分別吸取上述 3 種溶液 5 ～ 10 μL，點于同一硅膠 G 板上，以環己烷 - 乙酸乙酯（3 ∶1，V ／ V）為展開劑，展開前預飽和20 min，待展距約8 cm 時，取出，揮干溶劑，在紫外燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置處顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾。見圖1 A。

黃芪：取當歸鑒別項下水相，乙酸乙酯洗滌2 次（每次40 mL），水相用水飽和正丁醇萃取2 次（每次40 mL），合并上層溶液，氨試液洗滌2 次（每次20 mL），水浴蒸干，加甲醇1 mL 溶解固形物，作為供試品溶液。按黃芪三七合劑處方和工藝制備缺黃芪的陰性樣品，同法制得陰性對照品溶液。另取黃芪甲苷對照品適量，加甲醇制成1 mg／mL 的對照品溶液。按2015 年版《中國藥典（四部）》通則0502“薄層色譜法”項下方法，分別吸取上述3 種溶液5 ～10 μL，點于同一硅膠G 板上，以三氯甲烷-甲醇 - 水（13 ∶7 ∶2，V ／ V ／ V）2 ～ 10 ℃放置 12 h 以上的下層溶液為展開劑，展開前預飽和20 min，待展距約10 cm時，取出，揮干溶劑，噴以10%硫酸乙醇溶液，加熱至斑點清晰。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置處顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾。見圖1 B。

三七：以黃芪鑒別項下供試品溶液制備方法制備供試品溶液。按黃芪三七合劑處方和工藝制備缺三七的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。另取三七皂苷R1對照品適量，加甲醇制成1 mg／mL 的對照品溶液。后續操作同黃芪鑒別項下。結果供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置處顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾。見圖1 C。

黃芪、三七：由于黃芪甲苷和三七皂苷均屬三萜皂苷，結構相似。在同一展開系統中斑點清晰，分離度較好。為方便操作，將兩者采用同一展開系統同時進行鑒別。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置處顯相同顏色的斑點，各斑點分離度好。見圖1 D。

2.2 人參皂苷Rg1 含量測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Shimadzu C18柱（150 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈 - 水（19 ∶81，V ／ V）；流速：1 mL ／min；檢測波長：203 nm；柱溫：35 ℃；進樣量：10 μL。

2.2.2 溶液制備

取人參皂苷Rg1對照品適量，精密稱定，加甲醇制成質量濃度為 445 μg ／mL 的對照品貯備液，稀釋 10 倍，制成質量濃度為44.5 μg／mL 的對照品溶液。精密吸取搖勻后的樣品（批號為 0224）2 mL，置 25 mL 容量瓶中，用75% 甲醇定容，10 ℃ 下，6 000 r／min 離心 10 min，取上清液，經 0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續濾液，即得供試品溶液。按黃芪三七合劑處方和工藝制備缺三七的陰性樣品，同法制得陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學考察

專屬性試驗：精密吸取 2.2.2 項下 3 種溶液各 10μL，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，見圖2。結果在與對照品溶液色譜相同保留時間處陰性對照品溶液色譜無干擾峰，表明專屬性良好。

線性關系、檢測限（LOD）和定量限（LOQ）考察：分別精密吸取對照品貯備液適量，加甲醇稀釋成質量濃 度 分 別 為 17.80，26.70，35.600，44.50，66.75，89.00 μg ／mL 的溶液，按 2.2.1 項下色譜條件進樣測定。以人參皂苷 Rg1峰面積（Y）為縱坐標、質量濃度（X，μg ／ mL）為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程Y ＝ 3 332.2 X-11 443（R2＝ 0.999 7，n ＝ 6）。結果表明，人參皂苷 Rg1質量濃度在 17.80 ～89.00 μg ／mL 范圍內與峰面積線性關系良好。以3 倍信噪比對應的檢測水平計算，得 LOD 為 3.9 μg ／mL，以 10 倍信噪比對應的檢測水平計算，得 LOQ 為 5.0 μg ／mL。

精密度試驗：精密吸取2.2.2 項下對照品溶液10μL，按2.2.1 項下色譜條件重復進樣6 次，記錄峰面積。結果的 RSD 為 1.13%（n ＝6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取同一批（批號為0224）樣品，依法制備供試品溶液，室溫下分別于 0，2，4，6，8，10，24 h 時進樣測定。結果峰面積的 RSD 為 1.68% （n ＝ 7），表明供試品溶液室溫放置24 h 內基本穩定。

重復性試驗：取同一批（批號為0224）樣品，按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，按 2.2.1 項下色譜條件連續進樣6 次，測定。結果峰面積的 RSD 為1.42%（n ＝6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：精密吸取已知含量（0.565 1 mg／mL）的樣品1 mL，置25 mL 容量瓶中，平行6 份，分別精密加入對照品溶液（1.212 4 mg ／mL）0.5 mL，按 2.2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定。結果見表1。

2.2.4 樣品含量測定

取 3 批（批號分別為 0224，0225，0226）樣品各適量，按 2.2.2 項下方法制備供試品溶液，再按 2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算樣品含量。結果 3 批樣品人參皂苷 Rg1平均含量分別為0.590 7，0.571 0，0.565 4 mg ／mL。

3 討論

3.1 展開劑選擇

在黃芪薄層鑒別預試驗過程中嘗試了多種不同展開系統，結果陰性樣品始終存在干擾。進一步試驗發現，由于黃芪甲苷和人參皂苷Rg1兩者均為三萜皂苷類成分，極性相似，未能分離，故在陰性樣品中存在人參皂苷Rg1干擾現象。參考文獻［3］中黃芪甲苷與人參皂苷Rg1的分離方法，未能得到較好的結果。多次嘗試后發現，將三氯甲烷 - 甲醇 - 水（13 ∶7 ∶2，V ／ V ／ V）2 ～ 10 ℃ 放置12 h 以上的下層溶液作為展開劑，能較好地分離黃芪甲苷、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1等3 種結構類似化合物。為方便操作，特將黃芪與三七在同一薄層板上進行鑒別。結果色譜斑點清晰、分離度好，可為含有黃芪、三七的復方制劑的理化鑒別提供參考。

3.2 含量測定

前期基礎研究發現，黃芪三七合劑可延緩模型大鼠腎纖維化進程，抑制腎小管上皮細胞轉分化，并有一定抗氧化應激作用；同時研究證實，三七總皂苷中人參皂苷Rg1對糖尿病腎病模型大鼠腎功能指標具有一定改善作用［4］。其機制是通過減少細胞自噬和活性氧的產生，抑制氧化應激途徑，從而對醛固酮誘導致損的腎小管上皮細胞產生良好的保護作用［5］。因此，人參皂苷Rg1是本方的主要有效成分之一，故選擇人參皂苷Rg1作為本制劑質量控制的指標成分。試驗過程中考察了處理樣品的不同溶劑（甲醇、75%甲醇、50%甲醇、乙醇、75%乙醇、50%乙醇）對人參皂苷Rg1含量測定的影響。結果經75%甲醇處理后含量相對較高，同時易于濾過，故選用75%甲醇處理樣品。此外，還考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-磷酸水系統，結果以乙腈-水為流動相時，供試品溶液色譜峰峰形較好，分離度大于1.5，理論板數大于 6 000，拖尾因子在 0.95 ～ 1.10 之間。

3.3 方法評價

黃芪三七合劑臨床主要用于治療3-4 期慢性腎臟病，具有益氣養血、活血利水、健脾助運的功效，能使氣血健旺、瘀血消散，從而恢復部分腎臟功能。本試驗中建立了黃芪三七合劑中君藥黃芪，臣藥三七、當歸的定性鑒別及主要有效成分人參皂苷Rg1的含量測定方法，經方法學驗證，所建立的方法精密度高，重復性好，穩定可靠，可用于黃芪三七合劑的質量控制。