梨杷止咳合劑質(zhì)量標準研究*

符 冰 ，劉銳鋒△，趙偉國，王術(shù)玲，巫柳岑

（1. 廣東省中山市人民醫(yī)院，廣東 中山 528403； 2. 廣州中醫(yī)藥大學中藥學院，廣東 廣州 510006）

梨杷止咳合劑為中山市人民醫(yī)院驗方，由梨干、菊花、桑白皮、苦杏仁等8 味中藥制成，有清熱去燥、潤肺生津等功效，臨床用于治療肺燥咳嗽、喉癢干咳、久咳不止等癥。周俊等［1］對合劑中微生物限度進行了檢查，并對桔梗、甘草、菊花進行薄層色譜（TLC）鑒別，但缺少含量測定項。本研究中擬對合劑中的桑白皮、苦杏仁、枇杷葉進行定性鑒別，并對菊花中木犀草苷及3，5-雙咖啡酰基奎寧酸進行含量測定，為該合劑質(zhì)量標準的建立提供參考。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20A 型高效液相色譜儀（日本Shimadzu 公司）；WFH-201BJ 型紫外可見投射反射儀（上海精科實業(yè)有限公司）；聚酰胺薄膜（浙江省臺州市路橋四甲生化塑料廠）；硅膠薄層板（青島海洋化工廠分廠）；BP211D 型電子天平（德國Sartorius 公司）；點樣用毛細管（華西醫(yī)科大學儀器廠）；MODEL HN1006 型超聲清洗器（中國華南超聲設(shè)備廠）；雙槽層析缸（上海信誼儀器廠）。

1.2 試藥

梨杷止咳合劑（批號分別為20181216，20190415，20190521），缺桑白皮、苦杏仁、菊花藥材的陰性樣品，均為廣東省中山市人民醫(yī)院制劑室自制；木犀草苷對照品（麥克林公司，批號為 c805135，含量≥98% ）；3，5-雙咖啡?；鼘幩釋φ掌罚ㄉ虾Ｔ慈~生物科技有限公司，批號為B21539，含量≥98%）；綠原酸對照品（成都普菲德生物技術(shù)有限公司，批號為17101904，含量≥98%）；枇杷葉（批號為 190203）、菊花（批號為 180901）、桑白皮（批號為 180901）、甘草（批號為 20180830）、北沙參（批號為 20180903）、苦杏仁（批號為 190201）、桔梗（批號為20180819）、梨干（批號為20190401）藥材飲片均購自廣州康圣藥業(yè)有限公司；乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別

桑白皮：取樣品50 mL，加Na2CO3使之成為過飽和溶液，超聲（功率300 W，頻率40 kHz，下同）處理20 min，離心，收集上清液，用稀鹽酸調(diào)pH 至1 ～2，靜置30 min，濾過，濾液用50 mL 乙酸乙酯萃取2 次，合并萃取液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL 使溶解，即得供試品溶液，平行制備3 份。稱取桑白皮對照藥材2 g，同法制備對照藥材溶液。取缺桑白皮藥材的陰性樣品50 mL，同法制備陰性對照品溶液。取十二烷基磺酸鈉3 g、正丁醇6 mL、正庚烷 2 mL，加水 25 mL，攪拌溶解，放置 24 h 即得 O ／W 微乳液［2］。照 2015 年版《中國藥典（四部）》通則 0502“薄層色譜法”［3］項下方法，分別吸取上述 3 種溶液各 6 μL，分別點于同一聚酰胺薄膜上，以上述微乳液為展開劑，展開，取出，自然晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應(yīng)位置顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照無干擾。詳見圖1 A。

苦杏仁、枇杷葉：取樣品10 mL，采用大孔樹脂分離純化，用3 倍柱體積的水及10%乙醇依次沖洗，棄去洗液；用80%乙醇清洗大孔樹脂柱，洗脫液水浴蒸干，用 1 mL 甲醇溶解殘渣，即得供試品溶液［4］，平行制備3 份。稱取苦杏仁對照藥材2 g，置索氏提取器中，加二氯甲烷50 mL，加熱回流2 h，棄去二氯甲烷液，藥渣揮干，加甲醇30 mL，加熱回流30 min，放冷，濾過，濾液水浴蒸干，殘渣加入1 mL 甲醇溶解，即得苦杏仁對照藥材溶液；取枇杷葉10 g，按苦杏仁對照藥材溶液制備方法制得枇杷葉對照藥材溶液。取缺苦杏仁、枇杷葉藥材的陰性樣品2 mL，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。按2015 年版《中國藥典（四部）》通則0502“薄層色譜法”［3］項下方法，分別吸取上述 4 種溶液各4 μL，點于同一硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯 -甲醇 - 水（15 ∶40 ∶22 ∶10，V ／ V ／ V ／ V）的下層溶液為展開劑，展距約為10 cm，取出，立刻用0.8%磷鉬酸的15%硫酸乙醇溶液浸板，加熱到105 ℃至斑點顯色清晰。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應(yīng)位置處顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照無干擾。詳見圖1 B。

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex R Luna C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈 -0.5%冰醋酸溶液（15 ∶85，V ／ V）；流速：1.0 mL ／min；檢測波長：350 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

2.2.2 溶液制備

稱取木犀草苷、3，5-雙咖啡?；鼘幩?、綠原酸對照品適量，精密稱定，置同一50 mL 容量瓶中，以70%甲醇定容，搖勻，配成木犀草苷質(zhì)量濃度為80.07 μg／mL、3，5-雙咖啡?；鼘幩豳|(zhì)量濃度為 37.09 μg／mL、綠原酸質(zhì)量濃度為 64.56 μg／mL 的混合對照品溶液。精密量取4 mL，置10 mL 容量瓶中，加甲醇5 mL，超聲處理 5 min，加甲醇定容，搖勻，取上清液 1 mL，經(jīng) 0.45 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。按處方工藝取除菊花外的其他藥材，依法制備陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學考察

專屬性考察：精密吸取 2.2.2 項下 3 種溶液各 10μL，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定。結(jié)果木犀草苷峰保留時間為 25.7 min，3，5 -雙咖啡?；鼘幩岱灞Ａ魰r間為39.5 min；木犀草苷分離度為 1.7，理論板數(shù)為21 000；3，5-雙咖啡酰基奎寧酸分離度為 5.4，理論板數(shù)為16 710；基線分離良好，均能與雜質(zhì)分開，陰性對照無干擾（綠原酸受陰性對照干擾較大，不作為檢測指標）。色譜圖見圖2。

線性關(guān)系考察：精密吸取2.2.2 項下混合對照品溶液 1 mL，分別進樣 1，2，5，10，15，20 μL。以待測成分峰面積（Y）為縱坐標、進樣量（X，μg）為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程，木犀草苷為 Y1＝2 568 242.785 X1-19 971.392 79（R12＝0.999 8，n ＝6），3，5- 雙咖啡?；鼘幩釣?Y2＝ 1 716 451.385 X2-25 808.439 86（R22＝0.999 8，n ＝ 6）。結(jié)果，木犀草苷、3，5 - 雙咖啡?；鼘幩徇M樣量分別在 0.080 1 ～1.601 4 μg 和0.037 1 ～0.741 8 μg 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗：精密吸取2.2.2 項下混合對照品溶液，連續(xù)進樣6 次，測定峰面積。結(jié)果木犀草苷及3，5-雙咖啡?；鼘幩岱迕娣e的 RSD 分別為1.12% 和1.01%（n ＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取樣品（批號為20190415），依法制備供試品溶液，室溫下分別于 0，2，5，8，12，24 h 時按2.2.1 項下色譜條件進樣測定。結(jié)果木犀草苷、3，5-雙咖啡?；鼘幩岱迕娣e的 RSD 分別為1.87%和1.88%（n ＝6），表明供試品溶液室溫下放置24 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗：精密量取樣品（批號為20190415）6 份，按 2.2.2 項下方法制備供試品溶液，按 2.2.1 項下色譜條件進樣測定，計算樣品含量。結(jié)果木犀草苷、3，5-雙咖啡?；鼘幩崞骄糠謩e為 0.134 9，0.827 8 mg／mL，RSD 分別為 3.40%，3.00%（n ＝6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗：木犀草苷，精密量取樣品2 mL，共6 份，加入混合對照品溶液 3.2 mL；3，5-雙咖啡酰基奎寧酸，精密量取樣品2 mL，共6 份，加入混合對照品溶液4.5 mL。均按 2.2.2 項下方法制備供試品溶液，按 2.2.1項下色譜條件進樣分析，計算加樣回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗結(jié)果（n ＝6）Tab.1 Results of recovery tests（n ＝ 6）

2.2.4 樣品含量測定

取 3 批（批號分別為 20181216，20190415，20190521）樣品，按2.2.2 項下方法平行制備供試品溶液2 份，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，計算樣品含量和平均值。結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果（mg／mL，n ＝2）Tab.2 Results of content determination of samples（mg ／mL，n ＝ 2）

3 討論

3.1 檢測條件選擇

指標成分：梨杷止咳合劑組方中以梨干和菊花為君藥，因梨干為藥食同源藥材，成分多以微量元素為主，因此選取菊花的有效成分作為本合劑的質(zhì)量控制指標。2015 年版《中國藥典（一部）》規(guī)定，菊花質(zhì)量控制成分選用木犀草苷、3，5-雙咖啡?；鼘幩岷途G原酸，但合劑中桑白皮也含有綠原酸，考慮其受干擾較大，故選用木犀草苷和3，5-雙咖啡酰基奎寧酸為高效液相色譜法進行含量測定的指標成分。此外，批號 20190415 樣品與批號20181216，20190521 樣品在制備工藝中所用菊花的產(chǎn)地不同，故木犀草苷、3，5-雙咖啡?；鼘幩岷坑胁町?。

薄層色譜（TLC）條件：桑白皮的TLC 條件參照2015年版《中國藥典（一部）》，采用堿溶酸提法提取，考察不同展開系統(tǒng)，最終選擇O／W 微乳液做展開劑，相比于傳統(tǒng)TLC 的展開劑，O／W 微乳液作展開劑的TLC 圖中斑點更清晰、數(shù)目更多，且低毒，還具有明顯的熒光增強增敏效應(yīng)［5］。梨杷止咳合劑中苦杏仁、枇杷葉均含有苦杏仁苷，本試驗參照2015 年版《中國藥典（一部）》，前處理采用二氯甲烷提取，經(jīng)多次試驗發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生乳化現(xiàn)象，不利于繼續(xù)試驗，改用乙醚萃取可避免乳化［6］，但斑點不清晰，改用大孔樹脂洗脫，提取更完全，斑點清晰，分離更好。

流動相：預(yù)試驗中考察了乙腈 -0.05% 磷酸［7］，乙腈 -0.1% 磷酸［8］，乙腈 -0.5% 冰醋酸溶液［9］等體系，結(jié)果顯示，乙腈-0.5%冰醋酸溶液等度洗脫對成分的靈敏度更高，木犀草苷、3，5-雙咖啡?；鼘幩岣鱾€峰的分離度更好，峰形對稱，重復(fù)性較好，拖尾因子較小。

檢測波長：選擇木犀草苷和3，5-雙咖啡酰基奎寧酸含量的測定波長時考察了 350 nm［10］、327 nm［11］、284 nm、254 nm 4 個檢測波長，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，木犀草苷、3，5-雙咖啡酰基奎寧酸在350 nm 波長處響應(yīng)效果、分離度、重復(fù)性等均較好，因此確定350 nm 作為檢測波長。

3.2 方法評價

藥理研究表明，桑白皮水煎液有止咳效果［12］；苦杏仁苷對呼吸中樞有一定抑制作用，可使呼吸運動趨于安靜，最終達到鎮(zhèn)咳、平喘的作用［13-14］，且苦杏仁苷的藥理作用與枇杷葉止咳祛痰功效相對應(yīng)［15］；木犀草苷具有止咳、祛痰、平喘等功效［16］；3，5- 雙咖啡?；鼘幩峋哂锌咕?、消炎、止痛等功效［17］。因此，采用 TLC 法對梨杷止咳合劑中桑白皮、苦杏仁、枇杷葉進行定性鑒別，采用高效液相色譜法測定菊花中木犀草苷和3，5-雙咖啡酰基奎寧酸的含量。該方法樣品處理簡單，易操作，重復(fù)使用率高，精確度高，為其質(zhì)量控制提供了理論基礎(chǔ)，同時也為梨杷止咳合劑的進一步開發(fā)提供參考。