表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯對(duì)缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響

闞 桐，王 越，王瑞剛

0 引言

腦梗死發(fā)病率與死亡率逐年上升，氧化應(yīng)激、神經(jīng)細(xì)胞凋亡率增加是誘導(dǎo)腦梗死發(fā)生的重要原因[1-2]。氧糖剝奪/復(fù)氧損傷(OGD/R)誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞可作為探究腦缺血再灌注損傷的模型[3]。表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(Epigalocatechin gallate，EGCG)屬于綠茶茶多酚的主要成分，EGCG具有抗氧化、抗心肌缺血再灌注損傷的作用[4]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA MALAT1(Long non-coding RNA MALAT1，lncRNA MALAT1)可通過(guò)上調(diào)miR-146a的表達(dá)抑制MALAT1的表達(dá)，從而抑制炎癥反應(yīng)[5]。生物信息學(xué)分析顯示，微小RNA-2115-3p (microRNA-2115-3p，miR-2115-3p)可能是MALAT1的靶基因，2型糖尿病伴嚴(yán)重肢體缺血的患者中miR-2115-3p上調(diào)[6]。本研究采用OGD/R處理神經(jīng)細(xì)胞建立細(xì)胞損傷模型，探討EGCG對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 EGCG購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司(批號(hào)：MB1672，純度：95%)；大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞HT22(上海聯(lián)邁生物工程有限公司)；杜氏改良培養(yǎng)基(DMEM)、胎牛血清、胰蛋白酶、Opti-MEM血清培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Trizol試劑與Lipofectamine2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄與實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；miR-2115-3p寡核苷酸模擬物(miR-2115-3p mimics)及陰性對(duì)照mimic NC序列(miR-NC)、MALAT1小分子干擾RNA(si-MALAT1)、亂序無(wú)意義陰性序列(si-NC)購(gòu)自廣州銳博生物科技有限公司；pcDNA3.1購(gòu)自上海索寶生物科技有限公司；超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(Malondialedhyde，MDA)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；RIPA裂解液購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；兔抗鼠B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)蛋白(Bcl-2-associated X protein，Bax)、B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司；辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔二抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素與100 μg/ml鏈霉素的培養(yǎng)基，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合度時(shí)，使用0.25%胰蛋白酶消化，加入DMEM培養(yǎng)基制備細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為3×104個(gè)/ml，按照每孔150 μl的密度將細(xì)胞接種于96孔板，分別進(jìn)行氧糖剝奪4 h處理，隨后更換DMEM完全培養(yǎng)基復(fù)氧處理24 h[7]，將進(jìn)行氧糖剝奪/復(fù)氧損傷(OGD/R)的細(xì)胞作為OGD/R組。同時(shí)將正常培養(yǎng)的細(xì)胞作為Con組。分別使用不同濃度(25、50、100 μmol/L)的EGCG處理神經(jīng)細(xì)胞24 h[8]，隨后進(jìn)行OGD/R處理，分別記作EGCG-L組、EGCG-M組、EGCG-H組。將培養(yǎng)基更換為不含血清的DMEM培養(yǎng)基，參照Lipofectamine2000試劑盒說(shuō)明書(shū)分別將pcDNA、pcDNA-MALAT1轉(zhuǎn)染至神經(jīng)細(xì)胞，轉(zhuǎn)染6 h后將培養(yǎng)基更換為DMEM完全培養(yǎng)基，使用濃度為100 μmol/L的EGCG處理24 h，隨后進(jìn)行OGD/R處理，分別記作EGCG-H+pcDNA組、EGCG-H+pcDNA-MALAT1組。

1.2.2 檢測(cè)SOD、MDA含量 收集各組細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗滌，4 ℃條件下經(jīng)3 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，取上清，參照試劑盒說(shuō)明書(shū)分別檢測(cè)SOD、MDA的含量，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 取各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期神經(jīng)細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗滌，4 ℃條件下經(jīng)3 000 r/min轉(zhuǎn)速離心6 min，相同條件下使用PBS洗滌3次，棄上清，收集細(xì)胞沉淀，加入500 μl結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，依次分別加入5 μl Annexin V-FITC與5 μl PI，室溫振蕩孵育10 min，應(yīng)用FACS Calibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)檢測(cè)細(xì)胞中MALAT1、miR-2115-3p的表達(dá)水平 取各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期神經(jīng)細(xì)胞，采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，應(yīng)用Nanodrop2000c超微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將總RNA合成cDNA。MALAT1正向引物5′-CCCCTGGGCTTCTCTTAACA-3′，反向引物5′-TAGATCAAAAGGCACG GGGT-3′；miR-2115-3p正向引物5′-TTGTCCTTCATTCCACCGGA-3′，反向引物5′-TACAT GTTCCCACCCAGCAT-3′；GAPDH正向引物5′-AACGGATTTGGTCGTATTG-3′，反向引物5′-GGAAGATGGTGATGGGATT-3′；U6正向引物5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′，反向引物5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′，引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)合成。參照實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒配置反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40次循環(huán)。MALAT1以GAPDH為內(nèi)參，miR-2115-3p以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算MALAT1、miR-2115-3p相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)MALAT1的靶基因 starBase預(yù)測(cè)顯示MALAT1與miR-2115-3p存在結(jié)合位點(diǎn)，由此推測(cè)MALAT1可能靶向調(diào)控miR-2115-3p，利用基因突變技術(shù)將結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行突變，分別將含有結(jié)合位點(diǎn)與突變位點(diǎn)的序列插入熒光素酶報(bào)告基因載體分別構(gòu)建野生型載體WT-MALAT1、突變型載體MUT-MALAT1。分別將miR-NC、miR-2115-3p mimics與WT-MALAT1、MUT-MALAT1共轉(zhuǎn)染至神經(jīng)細(xì)胞，檢測(cè)各組細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性。分別將pcDNA、pcDNA-MALAT1、si-NC、si-MALAT1轉(zhuǎn)染至神經(jīng)細(xì)胞，采用qRT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞中miR-2115-3p的表達(dá)水平。

1.2.6 蛋白免疫印跡(Western blot)檢測(cè)Bax、Bcl-2蛋白表達(dá) 收集各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期神經(jīng)細(xì)胞，加入400 μl RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA法檢測(cè)蛋白濃度，蛋白變性，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，封閉，分別加入Bax (1∶1 000)、Bcl-2 (1∶1 000)與內(nèi)參蛋白GAPDH (1∶1 000)一抗稀釋液，4 ℃孵育24 h，TBST洗滌，加入二抗稀釋液(1∶2 000)，室溫孵育1 h，TBST洗滌，滴加ECL，顯影，應(yīng)用ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 EGCG對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響 與Con組比較，OGD/R組SOD含量降低(P<0.05)，MDA含量升高(P<0.05)；與OGD/R組比較，EGCG-L組、EGCG-M組、EGCG-H組SOD含量升高(P<0.05)，MDA含量降低(P<0.05)，且EGCG-L組、EGCG-M組、EGCG-H組間SOD、MDA含量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 EGCG對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響(n=9)

2.2 EGCG對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響 與Con組比較，OGD/R組細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05)，Bax蛋白水平升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平降低(P<0.05)；與OGD/R組比較，EGCG-L組、EGCG-M組、EGCG-H組細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05)，Bax蛋白水平降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平升高(P<0.05)，且EGCG-L組、EGCG-M組、EGCG-H組細(xì)胞凋亡率與Bax、Bcl-2蛋白水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖1、表2。

2.3 EGCG對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞中MALAT1、miR-2115-3p表達(dá)量的影響 與Con組比較，OGD/R組細(xì)胞中MALAT1的表達(dá)水平升高(P<0.05)，miR-2115-3p的表達(dá)水平降低(P<0.05)；與OGD/R組比較，EGCG-L組、EGCG-M組、EGCG-H組細(xì)胞中MALAT1的表達(dá)水平降低(P<0.05)，miR-2115-3p的表達(dá)水平升高(P<0.05)，且EGCG-L組、EGCG-M組、EGCG-H組間MALAT1、miR-2115-3p的表達(dá)水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表3。

圖1 EGCG對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響

表2 EGCG對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響(n=9)

2.4 MALAT1靶向調(diào)控miR-2115-3p starBase預(yù)測(cè)顯示，MALAT1的序列中含有與miR-2115-3p互補(bǔ)的核苷酸序列，見(jiàn)圖2。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染野生型載體WT-MALAT1的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，與miR-NC組比較，miR-2115-3p組熒光素酶活性降低(P<0.05)；共轉(zhuǎn)染突變型載體MUT-MALAT1的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，miR-2115-3p組熒光素酶活性與miR-NC組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表4。與pcDNA組比較，pcDNA-MALAT1組細(xì)胞中miR-2115-3p表達(dá)降低(P<0.05)；與si-NC組比較，si-MALAT1組細(xì)胞中miR-2115-3p的表達(dá)水平升高(P<0.05)，見(jiàn)表5。

表3 EGCG對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞中MALAT1、miR-2115-3p表達(dá)量的影響(n=9)

圖2 MALAT1的序列中含有與miR-2115-3p互補(bǔ)的核苷酸序列

表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)(n=9)

表5 MALAT1靶向調(diào)控miR-2115-3p的表達(dá)(n=9)

2.5 MALAT1過(guò)表達(dá)降低EGCG對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激及凋亡的作用 與EGCG-H+pcDNA組比較，EGCG-H+pcDNA-MALAT1組細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05)，Bax蛋白水平升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平降低(P<0.05)，SOD含量降低(P<0.05)，MDA含量升高(P<0.05)，見(jiàn)圖3、表6。

圖3 MALAT1過(guò)表達(dá)降低EGCG對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用注：A.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，B.Western blot法檢測(cè)Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)

表6 MALAT1過(guò)表達(dá)降低EGCG對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激及凋亡的作用(n=9)

3 討論

腦梗死患者腦部缺血后神經(jīng)細(xì)胞凋亡率明顯升高，進(jìn)而導(dǎo)致腦功能損傷甚至死亡，已嚴(yán)重影響患者生命安全。既往研究顯示，人參皂苷、三七總皂苷、紅景天苷等中醫(yī)藥物對(duì)缺血再灌注損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡等具有一定抑制作用[9-11]。但仍有部分中醫(yī)藥物在腦梗死治療過(guò)程中的作用機(jī)制尚未闡明。因此，本研究積極探尋新型缺血性腦部疾病治療藥物并探究其可能作用機(jī)制，為提高患者的治療效果提供新方向。

EGCG可通過(guò)抑制過(guò)氧化氫的生成及清除氧自由基等，對(duì)心肌缺血再灌注損傷發(fā)揮保護(hù)作用，還可通過(guò)抑制心肌細(xì)胞凋亡減緩心肌缺血再灌注損傷[12-13]。研究表明，EGCG在一定程度上可抑制神經(jīng)元凋亡，從而對(duì)繼發(fā)性脊髓損傷發(fā)揮保護(hù)作用[14]。但關(guān)于EGCG對(duì)缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制尚未完全闡明。氧化應(yīng)激主要是指機(jī)體氧化與抗氧化能力失衡，氧自由基的大量生成可促使腦缺血再灌注神經(jīng)細(xì)胞凋亡，抑制氧自由基的生成可抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而達(dá)到治療再灌注損傷的目的。研究表明，OGD/R可誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞中活性氧的生成量增加，SOD可清除氧自由基，從而減弱缺血損傷導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，而MDA屬于脂質(zhì)類(lèi)過(guò)氧化物，并可促進(jìn)氧自由基的生成[15-17]。本研究結(jié)果顯示，OGD/R處理后，神經(jīng)細(xì)胞中SOD含量降低，MDA含量升高，提示OGD/R誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)、OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷模型建模成功。本研究采用不同濃度的EGCG處理后，OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞中SOD含量升高，MDA含量降低，且隨著EGCG使用劑量的增加而顯著變化，提示EGCG可抑制OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞氧化損傷，且呈劑量依賴(lài)效應(yīng)。研究表明，Bcl-2屬于抗凋亡蛋白，Bax屬于促凋亡蛋白，Bax表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)線(xiàn)粒體釋放細(xì)胞色素C而激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[18]。本研究結(jié)果顯示，OGD/R處理后，神經(jīng)細(xì)胞凋亡率顯著升高，Bax表達(dá)上調(diào)，Bcl-2表達(dá)下調(diào)，而不同濃度的EGCG處理后，神經(jīng)細(xì)胞凋亡率顯著降低，Bax表達(dá)下調(diào)，Bcl-2表達(dá)上調(diào)，且呈劑量依賴(lài)效應(yīng)。提示EGCG可抑制OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

MALAT1可通過(guò)促進(jìn)SAA3表達(dá)而增強(qiáng)LPS誘導(dǎo)的膿毒性心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)[19]。MALAT1通過(guò)調(diào)控miR-150-5p/NF-κB分子軸，在敗血癥誘發(fā)的心臟炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[20]。本研究結(jié)果顯示，OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞中MALAT1表達(dá)水平升高，miR-2115-3p的表達(dá)水平降低，而不同濃度的EGCG處理后神經(jīng)細(xì)胞中MALAT1的表達(dá)水平降低，miR-2115-3p的表達(dá)水平升高，且呈劑量依賴(lài)效應(yīng)。進(jìn)一步分析顯示，MALAT1可靶向結(jié)合miR-2115-3p，并可負(fù)向調(diào)控miR-2115-3p的表達(dá)，提示EGCG可能通過(guò)下調(diào)MALAT1的表達(dá)及上調(diào)miR-2115-3p的表達(dá)從而減輕OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷。為驗(yàn)證上述推測(cè)，本研究將MALAT1過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至神經(jīng)細(xì)胞，使用EGCG處理后進(jìn)行OGD/R處理，結(jié)果顯示，miR-2115-3p的表達(dá)水平降低，細(xì)胞凋亡率升高，Bax蛋白水平升高，Bcl-2蛋白水平降低，SOD含量降低，MDA含量升高，說(shuō)明MALAT1過(guò)表達(dá)降低EGCG對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激及凋亡的作用。提示EGCG可通過(guò)調(diào)控MALAT1/miR-2115-3p分子軸，從而抑制OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激及凋亡。

綜上所述，EGCG可抑制OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡及減輕細(xì)胞氧化損傷，其作用機(jī)制與調(diào)控MALAT1/miR-2115-3p分子軸有關(guān)，可為缺血性腦疾病的治療提供新方向，還可為進(jìn)一步揭示EGCG在缺血性腦疾病治療中的作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。