濃香型白酒釀造車間空氣中酵母菌的分離鑒定及生長特性研究

黃治國 彭思婕 李 浩 鐘姝霞 鄧 杰 任志強 衛春會

(1. 四川輕化工大學釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室，四川 宜賓 644000；2. 四川水井坊股份有限公司，四川 成都 610036；3. 自貢檢驗檢測院，四川 自貢 643000)

濃香型白酒又稱瀘香型白酒，是中國四大典型香型白酒之一，以瀘州老窖特區酒為典型代表，屬于大曲酒，其主要的香型物質為己酸乙酯，酒體無色透明、窖香濃郁、綿軟甘冽、香味協調、尾凈爽口[1]。其中最能體現濃香型大曲酒釀造工藝獨特之處是“泥窖固態發酵、續糟配料、混蒸混燒”[2-3]。

傳統固態白酒釀造過程中，微生物對白酒的質量、品質、風味等有重要作用[4]，多數微量物質都是微生物的代謝產物[5]。大曲作為糖化發酵劑，是多種微生物群的混合體系[6]，微生物的生長繁殖形成了種類繁多的代謝產物，進而賦予大曲酒獨特的風格和特色[7]。曲中的微生物主要是從環境中富集而來，各種微生物互相作用進而影響發酵過程[8]。游玲等[9]研究表明窖泥、空氣、糟醅之間的微生物存在相互轉移，釀造過程中的霉菌、細菌、酵母菌大部分來自空氣，釀造環境空氣中的微生物是否在釀造特性方面有發展取決于環境條件。

目前，有關白酒微生物的研究主要是以酒醅或酒曲為出發點[10]，從微生物的角度探究白酒的發酵機理，并提出白酒微生物與風味之間的聯系是今后研究的重點[11]，尤其是不同香型白酒具有不同的風味特征，其中微生物的作用十分重要[12]。目前有關釀造過程中的細菌和霉菌的群落結構變化、群落結構與風味組分以及微生物群落與氨基酸含量的相關關系研究較多[13-17]，但未進行大量的菌落篩選，且空氣中酵母菌的產酒產香作用尚未見報道。文章擬以濃香型白酒釀造車間空氣微生物為研究對象，利用YPD培養基和麥芽汁培養基，對濃香型白酒釀造車間空氣微生物進行分離鑒定，并從中篩選出酵母菌；對酵母菌進行耐受特性分析，并采用GC-MS分析其代謝產物。旨在為白酒釀造機理以及引進新型養生酒的同時提高白酒質量提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

空氣微生物樣品：將取樣機置于釀造車間，對釀造車間空氣進行多點取樣并混合均勻作為試驗分析樣品，密封后于4 ℃保藏，川北某濃香型白酒廠；

瓊脂、葡萄糖、95%乙醇、濃鹽酸等：分析純，成都科龍化工試劑公司；

酵母浸膏、蛋白胨等：北京雙旋微生物培養基制品廠。

1.2 儀器與設備

氣相色譜質譜聯用儀：7890A-5975B型，美國安捷倫科技公司；

紫外可見分光光度計：A360型，上海翱藝儀器有限公司；

雙色熒光定量PCR儀：CFX96 型，美國BIO-RAD公司；

化學發光成像系統：ChemiDoc XRS型，美國BIO-RAD公司；

正置生物顯微鏡：DM3000型，德國Leica公司；

菌落計數分析儀：ProtoCOL3型，廣州市華粵行儀器有限公司；

電泳儀：Mini-subce11型，美國BIO-RAD公司；

高性能臺式離心機：X1R型，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；

離心機：5418型，艾本德(中國)有限公司；

均質器：Precellys24型，奧然科技有限公司；

恒溫培養振蕩器：ZWYR-D2403型，上海智城分析儀器制造有限公司；

微生物培養箱：LS-I201型，上海桑戈生物科技有限公司；

大型臺式恒溫冷凍搖床：MaxQ4000型，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；

超凈工作臺：SW-CJ-2D型，上海實業蘇凈有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 培養基制備

(1) YPD培養基：酵母膏10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1000 mL，121 ℃滅菌15 min。

(2) 馬鈴薯液體培養基：去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL，121 ℃滅菌15 min。

(3) 高粱汁培養基[18]：高粱粉250 g，耐高溫α-淀粉酶(10 U/g原料)45 mg，糖化酶(250 U/g原料)20 mg，酸性蛋白酶(30 U/g原料)30 mg，蒸餾水1 000 mL，糖度20 °Bx，115 ℃滅菌15 min。

1.3.2 空氣中微生物的分離純化及形態觀察 無菌條件下，取1 mL空氣樣品，加入9 mL無菌水，充分搖勻，振蕩5～10 min，梯度稀釋，選取10-3、10-5、10-7稀釋液各1 mL，均勻涂布于酵母膏胨葡萄糖瓊脂培養基，30 ℃培養48 h，根據菌種的生長狀況，選取適當的平皿，挑取單菌落，轉接于另一平皿。按此法重復轉接2～3次進行分離純化，根據菌落特征及鏡檢確認后，挑取單菌落移入斜面，培養后備用。對分離純化培養篩選出的菌株進行鏡檢，確定菌落形態。

1.3.3 酵母菌DNA的提取 取1 mL菌懸液進行活化，采用酶破碎法結合玻璃珠破碎法提取DNA。采用正向ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3)和反向引物ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)進行PCR擴增。具體反應程序：94 ℃預變性8 min；94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共29個循環；72 ℃延伸8 min，對擴增產物進行電泳檢測。

1.3.4 酵母菌的生長曲線及對乙醇、溫度、酸的耐受性

(1) 生長曲線：采用紫外可見分光光度計測定酵母菌數量，并繪制曲線圖。

(2) 乙醇耐受性：分別添加0%，3%，5%，7%，9%，11%乙醇至酵母菌液中，測定其吸光值。

(3) 溫度耐受性：取1 mL酵母菌懸液接種至馬鈴薯液體培養基中，以3 ℃為增長梯度，從20～41 ℃，共9個培養基，培養24 h，測定其吸光值。

(4) 酸耐受性：各取1 mL菌懸液接種至馬鈴薯液體培養基中，調節pH以0.5為梯度，從pH 2.0～6.0，每組9個培養基，28 ℃培養24 h，測定其吸光值。

1.3.5 酵母菌代謝產物分析 采用高粱汁培養基，分別接種酵母菌，28 ℃發酵3 d。采用GC-MS進行鑒定，利用NIST數據庫，分析發酵液中的代謝產物。

1.3.6 數據處理 采用SPSS軟件和Excel、Origin軟件等對數據進行處理分析。

2 結果與分析

2.1 空氣中酵母菌的分離純化

從川北某濃香型白酒廠釀造車間的空氣微生物樣品中分離純化得到4株酵母菌，分別編號為nz2、nz3、nz4、nz8，其菌落形態特征見表1。

表1 各菌株的菌落形態特征

2.2 基于5.8S rDNA-I TS區的分子鑒定結果

對分離純化后的4株酵母菌DNA進行提取，使用引物ITS1和ITS4對其5.8S rDNA-ITS區基因進行PCR擴增。由圖1可知，4株酵母菌的DNA擴增產物長度為500～750 bp。利用NCBI對菌株序列進行BLAST比對，并構造發育樹如圖2所示。

由圖2可知，nz2和nz3同屬于膠紅酵母(R.mucilaginosa)，nz4和nz8同屬于季也蒙畢赤酵母(M.guilliermondii)。趙春海等[19]研究發現膠紅酵母和季也蒙畢赤酵母均屬產油脂酵母類，可在一定條件下水解碳源、氮源產生脂肪酸。膠紅酵母包含獨特酶系，能很好分解酒中不良物質[20]，季也蒙畢赤酵母可將豐富原料發酵轉換成油脂和其他微量物質[21]，這兩株酵母均可適應環境并代謝產生有益物質，在釀造白酒的環境下，能夠產香、產醇，在篩選菌株時這兩株菌在培養基上生長繁殖會產生酒的香氣。葉偉慶[22]發現膠紅酵母菌可產生類胡蘿卜素、粗多糖、蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶、維生素B1、維生素B2、維生素B6等物質，其中類胡蘿卜素和維生素都是對人體有益的微量元素[23-24]。故可將膠紅酵母引入到白酒中使之發展成為新型養生酒。因此，選用其中的nz3和nz4兩株酵母進行生長曲線、耐受特性以及代謝產物分析。

M. DL2000 DNA marker 1. nz2的PCR產物 2. nz3的PCR產物 3. nz4的PCR產物 4. nz8的PCR產物圖1 酵母菌株的5.8S rDNA-ITS區基因PCR擴增結果Figure 1 DNA amplification resuLts of the strains

圖2 比對結果發育樹Figure 2 Phylogenetic tree analysis of the results compared

2.3 酵母菌生長曲線

由圖3可知，菌株nz3和nz4的生長趨勢大體一致，均先升高后降低。當培養時間為10～12 h時，兩株菌的OD值增長幅度相近，但變化不大，此期間為生長曲線中的延滯期；當培養時間為12～22 h時，兩株菌的OD值增長速率較大，接近于倍數增長，nz4的OD值較nz3更大，此期間為生長曲線中的對數期；當培養時間為22～33 h時，兩株菌的OD值的變化趨于平穩，先逐漸增大至最大值后降低，nz3的增長速率由小變大再降低，OD值在29 h處達最大，nz4的增長速率保持平穩再降低，OD值在30 h處達最大值且大于nz3的，此期間為生長曲線中的平穩期；當培養時間為33～34 h時，兩株菌的OD值均下降，且下降幅度較大，此期間為生長曲線的衰亡期。綜上，兩種酵母菌在29～30 h范圍內生長更好。

2.4 酵母菌的耐受性

2.4.1 耐乙醇性 由圖4可知，兩種酵母菌在不同乙醇濃度下變化趨勢基本一致，OD值逐漸減小并趨近于0。當乙醇體積分數為0%～5%時，兩種酵母菌的OD值下降幅度較大，當乙醇體積分數為5%時，nz3、nz4的OD分別為0.1，0.5左右；當乙醇體積分數為5%～11%時，nz3的OD值變化幅度較小，在乙醇體積分數為11%時變為0，nz4的OD值在乙醇體積分數5%～7%時下降幅度較大，在乙醇體積分數為7%～11%時，nz4的OD值持續減小并接近于0。同樣的生長條件下，nz4的OD值比nz3的更大，說明nz4的乙醇耐受性比nz3的更好。

圖3 兩株酵母菌的生長曲線Figure 3 The growth curve of two yeast strains

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖4 兩株酵母菌的乙醇耐受性Figure 4 Study on ethanol tolerance of two yeast strains

2.4.2 耐溫性 由圖5可知，兩種酵母菌的OD值變化趨勢一致，均先升高后降低。當溫度為20～29 ℃時，兩種酵母菌的OD值持續上升，在29 ℃時達最大值，且nz4的增長幅度更大；當溫度為29～44 ℃時，兩種酵母菌的OD值持續下降，nz3的下降幅度較大，在44 ℃時接近0，nz4在29～38 ℃時下降幅度較小，在38 ℃后急劇下降，44 ℃時接近0。同樣的生長環境下，nz4的OD值高于nz3，因此nz4的耐溫性更好。

2.4.3 耐酸性 由圖6可知，兩種酵母菌的OD值變化趨勢一致，均先平穩后上升再下降。當pH為2.0～3.5時，nz3的OD值是pH 3.0開始大幅度上升，在pH 3.5時達1.4左右，nz4的OD值從pH 2.0開始急劇增長，在pH 3.5 時達1.8左右；當pH為3.5～5.5時，nz3的OD值仍在增長，從1.4增長至1.6左右，而nz4的增長幅度較小，變化趨于平緩，在pH 5.5時達最大值1.9；當pH從5.5增加至6.0時，兩種酵母菌的OD值均下降至1.6左右。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖5 兩株酵母菌的溫度耐受性Figure 5 Study on temperature tolerance of two yeast strains

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖6 兩株酵母菌的酸度耐受性Figure 6 Study on the acidity tolerance of two yeast strains

同樣的生長環境下，nz4的OD值高于nz3，說明nz4在酸性條件下比nz3更適合生存。

綜上，空氣中的酵母菌在釀造特性方面表現優良，與酒醅或大曲中的酵母菌性能[25]相近，表明空氣中的酵母菌也能在釀造環境下很好地生長并代謝出有益物質，可進一步將空氣中微生物進行培養優化，使酒質更優、風味更佳。

2.5 酵母菌代謝產物

由表2可知，兩種酵母菌的優勢產物均為乙醇和己酸乙酯，并含有少量的酸、高級醇、酯類、酚類等芳香類物質，可構成白酒香味成分[26]，其中己酸乙酯是濃香型白酒的香味主體成分。nz3的代謝產物中乙醇和己酸乙酯含量較高，還產生了苯乙醇和2，3-丁二醇，這兩種物質是發酵產生的中間物，可以構成一些香味物質，能對酒體產生正面影響；nz4的代謝產物中乙醇、丁醇、苯乙醇、己酸乙酯、辛酸乙酯含量高于nz3，其發酵效果優于nz3。綜上，nz4的產酒能力和產香能力都較好，可對其進行進一步發酵試驗，并且通過觀察其產物的含量變化，利用生理生化試驗優化其產醇和產香的能力。此外，生香酵母用于濃香型白酒、醬香型白酒生產中對白酒產量的提高具有明顯效果[27-28]。因此，可以從生香方向研究篩選出的膠紅酵母和季也蒙畢赤酵母，對酵母菌的代謝產物進行分析，進一步探究其產酒、產香作用，使之可應用于白酒生產，賦予白酒風味物質，提高白酒質量。

表2 兩株酵母的發酵產物?

3 結論

以濃香型白酒釀造車間空氣微生物為研究對象，利用YPD培養基和麥芽汁培養基對其進行分離鑒定，并采用GC-MS分析技術，對空氣微生物中的酵母菌進行代謝產物分析。結果表明：① 空氣微生物中大部分可培養的微生物包含細菌、霉菌和酵母菌，并篩選鑒定出了兩種酵母菌，分別是膠紅酵母(R.mucilaginosa)和季也蒙畢赤酵母(M.guilliermondii)。② 兩種酵母菌最適生長時間為29～30 h，季也蒙畢赤酵母對乙醇、溫度、酸的耐受性優于膠紅酵母。③ 兩種酵母菌均可應用于釀造生產并提高酒質和風味，其優勢產物有乙醇、己酸乙酯，還有少量高級醇、酯類、酚類等芳香成分。試驗對酵母菌進行了分離，但是參與白酒釀造的微生物還有霉菌、放線菌等多種微生物[29]。因此，對空氣中微生物種類的篩選可多樣化，還可將試驗所得酵母菌與空氣中的霉菌、放線菌等結合，探究不同種類菌種的復合發酵效果。