平喘顆粒通過抑制miR-21的表達對氣道炎癥及Eotaxin mRNA的影響*

王 玨 孫麗麗 陳 璐 李竹英△

（1.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫藥大學，黑龍江哈爾濱 150040）

支氣管哮喘（簡稱哮喘）是一種發病率較高的呼吸系統慢性炎癥反應性疾病。有研究顯示，目前全世界有哮喘患者約1.5～2億人，在我國，14歲以上人群支氣管哮喘總體患病率為1.24%，大約有2 000萬的哮喘患者，患病率呈明顯上升趨勢［1］。平喘顆粒為黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院呼吸科治療哮喘的經驗方化裁而來，在改善患者臨床癥狀及肺功能，減少哮喘再發，減輕再發時癥狀，提高哮喘患者免疫力等方面有良好療效［2-3］。miR-21存在多種疾病中，有研究發現，miR-21在哮喘大鼠模型中表達顯著［4］，在哮喘發病中有重要調節作用。前期研究顯示［5］，平喘顆粒可降低哮喘大鼠EOS水平。因此推測平喘顆粒可能通過調節miR-21的表達降低Eotaxin及EOS水平，減輕氣道炎癥，從而起到治療作用。本研究通過抑制miR-21的表達，觀察肺泡灌洗液（BALF）及外周血中細胞EOS計數及Eotaxin mRNA的表達，進一步探討平喘顆粒可能降低EOS的機制。現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雌性Wistar大鼠，清潔級，120只，體質量（200±20）g，由依托單位實驗動物中心提供，合格證號：SCXK（黑）2008-004，使用許可證號：SYXK（黑）2014-002。動物飼料由依托單位動物實驗中心提供，實驗室溫度18～25℃，相對濕度40%～75%。

1.2 試藥與儀器 1）藥物。平喘顆粒：淫羊藿200 g，炙麻黃100 g，太子參150 g，黃芪150 g，五味子 150 g，款冬花150 g，地龍100 g，罌粟殼40 g，知母100 g。加水煎煮2次，每次2 h，濾過，取上清液回收乙醇并濃縮至稠膏，加入蔗糖、糊精適量，混勻，制成顆粒，干燥，最終質量1 000 g（由黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院制備，批號20150102）。2）試劑。卵蛋白（OVA，美國Sigma公司，批號AP0028），Real-time PCR試劑盒（瑞士Roche公司，批號0491391400），cDNA反轉錄試劑盒（北京全式金生物技術有限公司，批號J20519），miR-21抑制劑（美國Ambion公司，批號AM10206），miR-21陰性對照（美國Ambion公司，批號AM17010）。3）儀器。自制霧化箱（40 cm×35 cm×25 cm），肺功能儀（黑龍江中醫藥大學實驗室提供），超聲霧化器（江蘇魚躍醫療設備有限公司），PCR擴增儀（美國Bio-Rad公司），實時定量PCR儀美國Agilent公司，Image Pro Plus6.0圖像分析軟件（美國Media Cybernetics公司），全自動五類血液分析儀（美國貝克曼庫爾特股份有限公司）。

1.3 分組與造模 Wistar大鼠隨機分為正常組、模型組、miR-21抑制表達組、miR-21抑制表達載體對照組、miR-21抑制表達+中藥組、中藥組，每組20只。正常組不做任何處理；模型組、miR-21抑制表達組、miR-21抑制表達載體對照組、miR-21抑制表達+中藥組、中藥組造成慢性哮喘動物模型。miR-21抑制表達組、miR-21抑制表達載體對照組、miR-21抑制表達+中藥組在造模前給予miR-21慢病毒溶液（病毒數量1.0×108/mL）滴鼻，每次0.1 mL。每3日滴1次，共4次。滴鼻前后分別檢測血清中miR-21表達情況，表達差異達5倍以上認為造模成功，開始慢性哮喘造模。慢性持續期大鼠造模參照文獻［6-7］進行改進：大鼠適應性喂養1周后，應用卵蛋白吸入法建立哮喘大鼠模型，于實驗第0、12天，每只大鼠腹腔注射10% OVA溶液（含Ⅱ級1 mg OVA和100 mg氫氧化鋁凝膠的無菌抗原液致敏）1 mL致敏，此后每天用5% OVA激發30 min，持續5 d，然后隔日激發1次，共激發6周，造成慢性大鼠哮喘模型。

1.4 干預方法 正常組不做任何處理，模型組、miR-21抑制表達組、miR-21抑制表達載體對照組給予同等體積生理鹽水灌胃；miR-21抑制表達+中藥組、中藥組在第2次致敏后第4天開始給予中藥藥液灌胃，將中藥溶解為含藥量1 080 g/L溶液，按5 mL/kg灌胃。各組均于末次激發24 h后處死。

1.5 觀察指標 1）大鼠一般情況。觀察大鼠精神、體質量、呼吸、飲食等一般情況。2）大鼠BALF及外周血中EOS計數。主動脈穿刺采血后結扎，結扎右肺主支氣管。用含1%肝素的無菌生理鹽水經氣管插管后進行左肺支氣管肺泡灌洗，并且重復6次，同時回收BALF。采用血細胞分析儀檢測BALF和外周血中EOS的數量。3）大鼠氣道形態學檢測。在400倍光鏡下選擇3支具有完整橫斷面的中小支氣管，利用計算機圖像分析儀分別測支氣管壁內周長（Pi）、基底膜面積（WAi）、氣道平滑肌層面積（WAm），并使WAi、WAm與Pi的比值作為標化測量分別代表支氣管基底膜厚度（WAi/Pi）和平滑肌層厚度（WAm/Pi）。4）大鼠肺組織miR-21、Eotaxin mRNA檢測。取小鼠肺組織樣本，剪碎后Trizol提取總RNA，參照試劑盒說明書逆轉錄為cDNA，以β-actin為內參。引物序列如下；miR-21上游 5'-CCTGCCTGAGCACCTGCTGC-3'，下游 5'-GA CTGTGACGACTACCCCAA-3'；eotaxin上游 5'-TCAC?GCTGCAACCCATCTGC-3'，下游 5'-CCAAGGCCAAC CGCGAGAAGATGAC-3'；β-actin上游5'-ACTATCG?GCAATGAGCGGTTCC-3'，下游5'-GAGCCACCAATC?CACACAGAGT-3'。參照試劑盒說明進行擴增反應，PCR的循環條件：95℃ 30 s預變性，（95℃ 10 s，60℃40 s）×30個循環，得數據以2-ΔΔct計算目標基因的相對表達量。

1.6 統計學處理 應用SPSS25.0統計軟件。計量資料以（±s）表示，組間數據比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠一般生理狀態 正常組：大鼠毛發光亮，神態安靜，動作靈敏，呼吸平穩，飲食正常，大小便正常。模型組：大鼠精神狀態較差，隨著激發次數增多，呼吸加快、點頭樣喘息明顯，蜷伏不安，皮毛暗黃干澀無光澤、時有脫落，食量下降、體質量增加緩慢的癥狀。miR-21抑制表達組：大鼠安靜少動，毛發稍松散，偶有咳嗽、喘息癥狀，食欲良好，個別大鼠出現互相撕咬。miR-21抑制表達載體對照組：大鼠活動明顯減少或難以行動，反應遲鈍，精神狀態較差，毛發倒立、無光澤，隨著激發次數增多，大鼠出現鼠毛蓬松，食量、體質量下降等癥狀。miR-21抑制表達+中藥組：哮喘激發開始后，大鼠偶可出現搔鼻、咳嗽、喘息等癥狀。經平喘顆粒治療后，大鼠上述癥狀緩解，毛發松散、有光澤，食量較好，體質量增加。中藥組：經平喘顆粒治療后，癥狀較模型組有所緩解，呼吸逐漸平穩，皮毛有光澤，活動度、食量、體質量逐漸恢復。

2.2 各組大鼠BALF及外周血中細胞EOS計數 見表1。與正常組比較，模型組BALF及外周血中EOS的數量明顯升高（P＜0.01），中藥組治療可顯著降低BALF及外周血中EOS的數量（P＜0.01）；miR-21抑制表達組數量低于模型組（P＜0.01），與miR-21抑制表達載體對照組比較，miR-21抑制表達組BALF及外周血中EOS的數量明顯降低（P＜0.01），miR-21抑制表達+中藥組治療可顯著降低BALF及外周血中EOS的數量（P＜0.05或P＜0.01）。

表1 各組大鼠BALF及外周血中細胞EOS計數比較（×105/L，±s）

表1 各組大鼠BALF及外周血中細胞EOS計數比較（×105/L，±s）

注：與正常組比較，##P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01；與miR-21抑制表達組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與miR-21抑制表達載體對照組比較，◇◇P＜0.01。下同。

外周血中EOS計數7.03±3.07 32.66±5.12##31.71±2.58**◇◇32.11±5.60##21.67±4.54△◇◇24.71±3.93##**組別正常組模型組miR-21抑制表達組miR-21抑制表達載體對照組miR-21抑制表達+中藥組中藥組n 20 20 20 20 20 20 BALF中EOS計數5.79±3.13 33.10±5.61##24.88±5.81**◇◇31.62±4.14##20.90±5.64△△◇◇26.96±5.34##**

2.3 各組大鼠氣道形態學變化比較 見表2，圖1。與正常組比較，模型組WAi/Pi、WAm/Pi比值明顯升高（P＜0.01），中藥組可顯著降低WAi/Pi、WAm/Pi比值（P＜0.01）；miR-21抑制表達組比值低于模型組（P＜0.01），與miR-21抑制表達載體對照組比較，miR-21抑制表達組WAi/Pi、WAm/Pi比值明顯降低（P＜0.01），miR-21抑制表達+中藥組治療均可顯著降低WAi/Pi、WAm/Pi比值（P＜0.05或P＜0.01）。

表2 各組大鼠氣道形態學變化比較（μm2/μm，±s）

表2 各組大鼠氣道形態學變化比較（μm2/μm，±s）

組別正常組模型組miR-21抑制表達組miR-21抑制表達載體對照組miR-21抑制表達+中藥組中藥組n 20 20 20 20 20 20 WAi/Pi 24.10±5.38 51.17±4.69##39.43±5.39**◇◇50.11±5.32##33.88±7.07△△◇◇42.75±5.60##**WAm/Pi 17.55±5.19 50.65±6.26##39.73±5.62**◇◇51.68±5.50##35.88±4.48△◇◇40.21±4.57##**

圖1 各組大鼠肺組織病理變化（HE染色，400倍）

2.4 各組大鼠肺組織miR-21、Eotaxin mRNA表達量比較 見表3。與正常組比較，模型組miR-21、Eotax?in mRNA表達量比值明顯升高（P＜0.01），中藥組治療可顯著降低miR-21、Eotaxin mRNA表達量（P＜0.01）；miR-21抑制表達組表達量低于模型組（P＜0.05或P＜0.01），與miR-21抑制表達載體對照組比較，miR-21抑制表達組miR-21、Eotaxin mRNA表達量明顯降低（P＜0.01）；與miR-21抑制表達組比較，miR-21抑制表達+中藥組治療均可顯著降低miR-21、Eotaxin mRNA含量（P＜0.05或P＜0.01）。

表3 各組大鼠肺組織miR-21、Eotaxin mRNA表達量比較（±s）

表3 各組大鼠肺組織miR-21、Eotaxin mRNA表達量比較（±s）

組別正常組模型組miR-21抑制表達組miR-21抑制表達載體對照組miR-21抑制表達+中藥組中藥組n 20 20 20 20 20 20 miR-21/β-actin 1.06±0.20 4.80±0.25##3.22±0.15**◇◇4.87±0.17##1.92±0.15△△◇◇3.50±0.21##**Eotaxin/β-actin 0.39±0.026 1.11±0.072##0.75±0.098*◇◇1.09±0.25##0.54±0.033△◇◇0.64±0.57##**

3 討 論

《臨證指南醫案·哮》云“邪散則喘亦止，后不復發……若因根本有虧，腎虛氣逆，濁陰上逆而喘者，此不過一二日之間，勢必危篤……若夫哮證……邪伏于里，留于肺俞，故頻發頻止，淹纏歲月”。宿痰伏肺是哮喘發病的基礎，腎陽虧虛貫穿發病始終［8］，哮喘病機多虛實夾雜，二者相互影響，疊加復重，導致哮喘遷延難愈，發病關鍵在于“陽虛痰盛”。治療用溫陽益氣、平喘化痰法，依據該法組成溫陽益氣化痰平喘方，并對該方化裁，制備成平喘顆粒，由淫羊藿、炙麻黃、太子參、黃芪、五味子、款冬花、地龍、罌粟殼、知母組成。方中淫羊藿、炙麻黃為君藥，有溫陽平喘之功；太子參補氣生津，黃芪益氣升陽，五味子、款冬花斂肺潤肺，地龍配麻黃加強平喘之效，以上5味共為臣藥；罌粟殼為佐藥，起斂肺止咳之效；知母為使藥可以引藥歸經，潤肺止咳，有補虛之用。方中藥物合用升降有序，收散并施，使腎陽得補，肺陽得溫，痰濕得化，咳喘得消。

近年來研究Micro RNA與哮喘相關性較多，其中miR-21備受關注。有研究指出［9］，哮喘的炎癥miR-21表達與哮喘的癥狀和炎癥反應程度呈正相關，可能是控制哮喘重要指標。同時應用miR-21拮抗劑可選擇性下調miR-21的表達，降低BALF中細胞總數和嗜酸性粒細胞計數，以及IL-4在內的Th2細胞因子水平，降低氣道EOS浸潤［10-11］。哮喘是一種氣道慢性炎癥性疾病，其病理改變為炎性細胞浸潤［12］。EOS作為哮喘炎癥的最主要標志之一，在哮喘的發病中起重要作用。成熟的EOS由骨髓CD34+祖細胞增殖活化而成［13］，可分泌多種炎癥介質，致使平滑肌痙攣和微血管通透性增加［14］，同時大量炎癥因子可調節其生成［15］，介導和促進氣道炎癥產生。Eotaxin為CC亞族趨化因子，為EOS的催化劑，對炎癥細胞的活化、聚集起重要作用，使EOS從血液募集到氣道上皮，通過釋放各種炎癥介質致使氣道上皮損傷［16］。從查閱相關文獻中發現，其三者可能具有相關性，由此猜測miR-21能夠調控Eotaxin，從而影響EOS水平，并用實驗進行驗證。

本研究結果顯示，模型組與空白組比較，miR-21、Eotaxin mRNA、BALF及外周血中細胞EOS明顯升高，而miR-21抑制表達組以上指標明顯降低，提示抑制miRNA的表達可以影響Eotaxin mRNA及BALF及外周血中細胞EOS水平。miR-21抑制表達+中藥組與miR-21抑制表達載體對照組比較，miR-21、Eotaxin mRNA、BALF及外周血中細胞EOS明顯降低；中藥組與模型組比較，以上指標明顯降低，提示平喘顆粒可以通過抑制miR-21的表達，降低大鼠肺組織Eotaxin mRNA及BALF及外周血中細胞EOS水平，改善氣道形態學變化，從而減輕氣道炎癥。

綜上所述，平喘顆粒能夠通過抑制miR-21的表達，降低Eotaxin mRNA表達，從而影響EOS水平，減輕氣道炎癥，起到治療哮喘的作用。