基于雙磁路磁珠法的血凝儀檢測模塊設計

李少敏 ，張興偉，秦軍芳，趙永杰，謝釗宏 ，盧新建，劉麒昊

1 汕頭大學，汕頭市，515063

2 汕頭大學醫學院第二附屬醫院，汕頭市，515063

3 廣州埃克森生物科技有限公司,廣州市，510663

4 廣東省智行機器人科技有限公司，佛山市，528226

0 引言

血小板、血液流變、血管以及凝血因子和血栓的產生和調節有著密切的聯系，它們通過自有的抗凝或促凝作用，使得人體中形成了抗凝和凝血這兩個功能對立的系統。他們相互制約，彼此間維持一種動態平衡，使得血管中的血液可以正常循環流動，即不會出現血液在血管中發生凝固（即血栓）現象，也不會出現血液流出血管的出血現象[1-2]。

血凝研究可以追溯到17世紀，William Harvey在其著作中描述了血液循環的規律[2-3]，1835年組織因子被發現，1882年血小板被指出，隨后Paul Morawitz醫生提出的第一次凝血描述為凝血級聯反應奠定了基礎[2-3]。隨著肝素的發現、凝血時間測試的進行，凝血酶原和抗凝劑也開始被使用[4]。凝血因子的發現和凝血級聯的提出加速了凝血研究[3,5]。

血液凝固分析儀，即血凝儀，是一個集機械、光學、流體、電子、軟件、臨床等多學科的產品，主要是對凝血酶原時間（PT）、活化部分凝血活酶時間（APTT）、纖維蛋白原（FIB）、凝血酶時間（TT）等與血栓和止血密切相關的的項目進行檢測，通過檢測凝固過程中的各個因子，從不同方面來認識研究各種相關疾病的病發機制以及病理過程，從而實現對它們的診斷與相對應的治療[6-7]。

20世紀90年代末，隨著第一條完全自動化的生產線被整合到醫學實驗室，全自動血凝儀應運而生，擺脫了傳統手工法的繁瑣、低效率、低精度和單一性，使得止血和血栓項目檢測變得簡便又靈敏、高效且可靠[8-10]。

目前，血凝市場上的常見進口儀器如日本希森美康CA系列，西班牙沃芬ACL TOP系列，法國斯塔高STA系列，德國BE系列等。常見的國產血凝檢測設備如北京普利生C2000-A高水平血凝儀、賽科希德SF-8000全自動血凝儀等。由于國內關于凝血儀的相關研究起步晚于國外發達國家，因而國產血凝檢測設備的總體水平距國際先進水平尚存在一定的距離。隨著近年來精準醫療的大力推進，市場競爭對國產血凝儀的品質要求不斷提高，急需研制一批運行平穩、準確性高的國產檢測設備，并形成自主知識產權，推進醫療器械生產企業的技術創新以提高其產品的市場競爭力，因而需要對一些新的血凝檢測方法進行研究和測試。在對目前血凝市場上各種凝血檢測產品及各種檢測原理深度調研和研究的基礎上，我們提出了一種基于雙磁路磁珠法的血凝檢測方法，并進行了初步的測試驗證。

1 凝血檢測方法

凝血酶原時間（PT）、活化部分凝血活酶時間（APTT）、凝血酶時間（TT）、已經纖維蛋白原（FIB）是凝血四項常規檢測項目，而目前常用的凝血檢測方法主要有底物顯色法、免疫學和凝固法等。

底物顯色法，亦可稱作生物化學法，是通過測定產色底物的吸光度變化來推測待測樣本的活性和含量的。檢測光源一般選擇波長為405 nm的鹵素燈。在目前幾十種人工合成的多肽底物中，最常用的是黃色的對硝基苯胺（PNA）[11-12]。底物顯色法靈敏性高、成本低廉，但在重復性和穩定性方面卻有較大不足[13-14]。

免疫學方法是指將純化的待測物質作為抗原，制備相應的抗體，然后利用抗原抗體特異性結合反應對待測物質進行定性和定量測定。比較常用的是酶聯免疫吸附試驗（ELISA法）和免疫比濁法[1,15-16]。免疫學方法檢測準確、受外界因素干擾較小，但其檢測試劑價格較高且大多被國外公司壟斷[13-14]。當檢測特殊血漿時，主要采用底物顯色法與免疫學方法。

凝固法，稱作生物物理學法，是血凝分析儀和血栓或止血實驗中最基本、最常用的方法。模擬血液發生凝固的環境，加入相關試劑，啟動凝血級聯反應，也即凝血瀑布效應，使待測血液中纖維蛋白原轉變為交聯纖維蛋白，使血液樣本發生凝固。在這一反應過程中，持續檢測其中的物理因素的變化即可確定反應時間[17]。凝固法又分為電流法、光學法（又叫比濁法）、磁珠法。電流法由于其檢測的單一性及可靠性不高已逐步被光學法代替。光學法更靈敏、更易擴展但對測試杯光潔度有較高要求。而基于血漿粘度進行檢測的磁珠法在凝血過程中可以擺脫異常血漿（如溶血、脂血、黃疸等特異樣本）的影響，甚至加樣中的氣泡也不影響測試精度[18-19]。為此，我們選擇磁珠法作為凝血儀的凝血檢測方法。

磁珠法主要包括平面磁珠法、光電磁珠法以及雙磁路磁珠法。早期的磁珠法也叫平面磁珠法，將一顆磁珠放在反應杯中，并緊貼杯外的一根鐵磁金屬桿，兩者之間呈一條直線，隨著樣品的凝固，纖維蛋白凝塊形成，使磁珠位置發生變化偏離金屬桿，儀器根據變化出現的時間來判斷凝固時間。此方法基于粘度變化來檢測，對試劑用量的要求較少，而且可以有效解決光學法中樣品的本底干擾，但其靈敏度非常低[15-16]。

光電磁珠法是以光學法作為檢測基礎，同時結合磁珠法不受特異樣本干擾的優點，開發的一種新的檢測方法。檢測過程和雙磁路磁珠法很相似，其不同點是利用光學的方法來判斷磁珠的運動狀態，通過光學檢測系統進行動態速率掃描，測試出多組數據并描繪出相應實驗的檢測曲線，經計算機芯片處理后，將凝固瞬間線性區的分析結果轉化為凝固結果。經大量臨床實驗證明，這一方法受黃疸、超高和低纖維蛋白原的各種異常血漿的干擾小，檢測結果的精確性正逐步提高[19]。

雙磁路磁珠法是基于被測血漿的粘度在凝固過程中會不斷增加而發展的方法，其原理示意圖如圖1所示。在檢測杯四周設置四個線圈，兩個相對的驅動線圈和兩個相對的感應線圈，檢測杯內加入血漿和特制的去磁小鋼珠，雙磁路磁珠法測試流程如圖2所示，首先對兩個驅動線圈交替通電，線圈由于電磁感應現象產生磁場，磁珠在場中受到磁化，磁場的作用使得磁珠在杯底周期性來回運動（可充分混勻待測樣品與試劑）從而切割磁感線，引起檢測杯旁兩個相對的感應線圈內磁通量變化，產生感應電流。磁珠的切割運動越快，感應電流強度越大。加入凝血試劑后（試劑需覆蓋杯底運動的鋼珠[15,20]），纖維蛋白凝塊的數量增大，血漿粘度增大，導致磁珠受到流體阻力的影響更大，運動速度減慢，感應線圈內的電流也減小，所以，測定感應電流的變化情況可以判斷血液是否凝固，凝固時間取振幅減弱到50%時所用的時間。根據不同的測試項目可選用不同的磁場強度[18,21-22]。

圖1 雙磁路磁珠法測試原理圖[19]Fig.1 Principle diagram of dual-magnetic circuit beads method

圖2 雙磁路磁珠法測試流程圖Fig.2 Test flow chart of dual-magnetic circuit beads method

2 檢測模塊總體設計

傳統磁珠法的儀器結構較為復雜，并且磁珠本身就是消耗品，纖維蛋白生成后不僅會吸附在檢測杯內壁，也會吸附在磁珠周圍，使得磁珠法的使用成本大大提高。為了解決這一問題，部分學者提出一種磁珠再生方法，使得磁珠可以重復利用從而降低磁珠使用成本[23]，但是此法會極大地加重檢測工作量。在綜合考慮各方面因素后，本團隊將在雙磁路磁珠法基本檢測原理的基礎上進行一些改進，在不失檢測精度的前提下使得相關檢測結構更加簡單。

目前市場上部分血凝儀采用光學法或者磁珠法進行凝血檢測，也有部分儀器同時采用這兩種檢測方法。由于光學法和磁珠法所用的檢測杯在結構形式上有很大的不同，同時使用兩種方法進行檢測時杯子占據的空間較大。為使檢測杯不至于占據太大的空間而導致血凝儀整體體積變大，應設計一種檢測杯能同時滿足光學法和磁珠法的檢測要求。出于這一考慮，將雙磁路磁珠法所用檢測杯的形式進行了改進，將其設計成與光學法所用檢測杯很相似的平底圓柱形杯子，所設計的雙磁路磁珠法檢測方案原理，如圖3所示。

在圖3中，檢測杯正下方設置一偏心軸，偏心軸下方設置有一電機，電機轉動可帶著偏心軸轉動。傳統的雙磁路磁珠法測量原理是在檢測杯四周通過兩兩相對的四個線圈來吸引磁珠切割磁場線做往復運動和測量其中磁場強度的變化來進行凝血反應的實驗。而我們的方案在不脫離粘度檢測原理的前提下，將線圈減少為一個驅動線圈和一個檢測線圈，且兩個線圈都布置在檢測杯的杯底，不僅減少了雙磁路磁珠法的硬件成本，也降低了雙磁路磁珠法的結構復雜程度。同時，由于四周沒有線圈擋住，可以利用機械傳動實現多個或者一排檢測杯逐一檢測。兩個線圈繞在偏心軸外部，靠近電機的線圈為驅動線圈，其通電后產生磁場，相比于永磁鐵產生的磁場，電磁鐵的磁場強度是可調節的，有利于對不同測試項目采用不同的磁場強度。驅動線圈產生磁場后，偏心軸同時受到磁化，偏心軸沿軸心轉動時，可吸引檢測杯內的去磁小剛珠沿杯底圓形軌道運動，靠近檢測杯側是檢測線圈，用以檢測磁珠運動過程中磁場變化引起的感應電流變化。將檢測線圈放置在靠近檢測杯一側有利于提高檢測精度。

圖3 改進雙磁路磁珠法檢測原理圖Fig.3 Principle diagram of improvement dual-magnetic circuit beads method

在整個檢測過程中，電機以向前90o再向后60o的方式轉動，在未加入試劑之前，由于偏心軸繞有驅動線圈，磁珠也會在檢測杯內跟隨電機轉動的方式轉動，此時檢測線圈內磁通量沒有顯著變化，感應信號保持穩定。當加入試劑后，隨著凝血反應的進行，血漿粘度上升，磁珠受到的粘性阻力增大，纖維蛋白細絲形成時，磁珠無法跟隨磁場轉動，磁珠停止并導致感應信號減少。當軸轉回到磁珠的位置時，信號又有所增加，通過測定信號發生變化的時間便可確定凝血時間。

2.1 磁珠所受流體阻力

精確描述不可壓縮粘性流體流動的基本力學規律需要求解納維-斯托克斯方程（簡稱N-S方程），但是N-S方程是一個非線性偏微分方程，目前只有在某些十分簡單的流動問題上才能求得精確解，但在特殊情況下，可以簡化方程而得到近似解[21,24]。OSEEN、WHITE等在N-S方程中保留了部分慣性力項，得到流體作用于球體上的力為[25-26]：

式中，Uα為流體的速度，Up為顆粒的速度，γp為顆粒半徑，Re為雷諾數；而流體作用在顆粒的力（即粘性阻力）取決于相對速度Uα-Up。在OSEEN工作基礎上WHITE進一步提出流動阻力系數的曲線擬合經驗公式[26]：

本研究中磁珠在血漿中運動時，其雷諾數大約在幾十到上百之間，如圖4所示[29]，在阻力危機[24,27]出現之前，擬合公式誤差約為±10%，基本滿足了磁珠在血漿中阻力計算的要求。

圖4 球體阻力系數，實驗值、理論值、經驗公式的比較Fig.4 Comparison of drag coefficients of spheres,comparisons of experimental values,theoretical values and empirical formulas

上述模型都立足于小球處于無界流體中運動，而磁珠在血漿中運動是有界的，并且球管徑比a/b較大，因而需要考慮杯子內壁對阻力系數的影響。考慮到管壁對小球運動會產生影響，Haberman提出一個修正系數KD，其近似表達式如式(3)所示[28-29]。

而Haberman得到的球體阻力公式為[29]：

式(3)中m為小球內外介質粘性系數的比值，對于固體圓球，其粘度可視作無限大，則m→∞。據Haberman所做的實驗結果顯示，在球管徑比a/b＜0.5范圍內，與理論計算結果相比，修正后球體阻力的計算結果與實驗結果符合程度相當高[28-29]。

2.2 磁珠所受磁場力

在本研究中，去磁小鋼珠直徑為2 mm，小鋼珠在磁場中受到的磁力F(i,x)為

式中μ0為真空磁導率；S為鐵心磁極面積；n為線圈匝數；i為線圈通電電流；x為磁極到球心的距離。

2.3 電機的選型

檢測模塊中的電機用于帶動如圖5所示的偏心軸旋轉。該偏心軸從最左端L1=3.5 mm，d1=1.5 mm的軸頭，通過L2=31 mm,d2=6 mm的軸徑，L3=1.5 mm,d3=9 mm的過渡軸肩連接到L4=8 mm，d4=3 mm的凸輪軸，經由L5=0.4 mm，d5=2.9 mm的第二根軸徑連接到最末端L6=6.6 mm，d6=3 mm的齒輪軸。該偏心軸偏心距s=2 mm。偏心軸的材料為硅鋼，其密度為7.6×103kg/m3，其轉動慣量I偏為38.423×10-9kg·m2。中間軸的材料為黃銅，密度為8.6×103kg/m3，轉動慣量I中為2.325×10-9kg·m2，則負載總慣量為40.748 kg.m2。

電機轉動要求為在1.5 s之內完成一圈，因為其轉動方式為向前90o再向后60o，故而，在一圈之內包括12次向前和12次向后，假設其向前向后的時間滿足3:2的關系，可求得向前時間為0.075 s，向后時間為0.05 s，取加減速時間均為0.01 s，考慮到其他位置尺寸，電機直徑最好不大于20 mm。

圖5 偏心軸實物圖Fig.5 Physical drawing of eccentric shaft

通過圖6繪制的電機三維實體模型進行分析模擬之后，選擇AM1524-V-12-150-55步進電機（部分參數見表1），兩相，24步旋轉一圈，外徑15 mm，配合16/7系列一級行星減速箱，減速比3.71:1，機械效率0.9。并配合以馮哈伯電機減速箱組合件。

圖6 檢測模塊PROE三維圖（電機）Fig.6 The PRO-E 3D model of detection module (motors)

表1 AM1524-V-12-150-55型電機部分參數Tab.1 Partial parameters of AM1524-V-12-150-55 motors

由表1可知，慣量條件：負載點移動慣量40.748×10-9kg.m2＜轉子轉動慣量45×10-9kg.m2負載慣量滿足要求。

滾動軸承摩擦力矩M=μ Pd/2，其中μ為摩擦系數；P為軸承負荷；d為軸承公稱內徑。代入數據，μ=0.001 3，P=3×9.8 N，d=3 mm，得M=0.114 66 mN.m。

根據以上數據作出電機在其兩種轉動方式下的電機扭矩與轉速曲線如圖7和圖8所示。步進角為向前90o運轉時電機在加速、勻速、減速過程中的扭矩如圖7(a)所示，最大扭矩與最小扭矩分別為0.475 5 mN.m和 0.424 3 mN.m。最大轉速為856.154 r/min。從圖8(a)的曲線中可以看出，向前90o的工作條件下，電機的扭矩和轉速都在該電機的允許范圍之內（黑色實線），考慮到30%的安全系數（黑色虛線）的話，其結果仍滿足要求。

步進角為向后60o運轉時電機在加速、勻速、減速過程中的扭矩如圖7(b)所示，最大扭矩與最小扭矩分別為0.507 5 mN.m和0.424 3 mN.m。最大轉速為1 391.25 r/min。從圖8(b)中可以看出，向后60o條件下，電機的扭矩和轉速都在該電機的允許范圍之內（黑色實線），考慮到30%的安全系數（黑色虛線），其結果仍滿足要求。

圖7 電機扭矩Fig.7 Torque profile of the motor

圖8 電機的扭矩與轉速曲線Fig.8 Torque and speed profile of the motor

3 測試結果分析

為了驗證改進后的雙磁路磁珠法，我們對檢查模塊中的磁場進行了調試并分析了磁場規律，此外還對血漿的活化部分凝血活酶時間（APTT）進行了測定。

現有血凝儀模塊中多達4個測量通道，如圖9所示，部分組成結構如圖10所示。雙面齒同步帶（圖中未顯示）帶動檢測杯移動到檢測位，開始第一排檢測杯的檢測，第一排檢測完成后，雙面齒同步帶繼續運動使得第二排檢測杯來到檢測位繼續檢測，如此反復，可實現多項目、多人數高效的同時檢測。

圖9 檢測模塊PROE三維圖Fig.9 The PRO-E 3D model of detection module

圖10 檢測模塊實物圖及線圈Fig.10 Physical drawing and coil of detection module

3.1 磁場調試及其規律

為了使磁場能拉動在血漿中的小球按照電機轉動的方式轉動，必須調節好模塊中的磁場強度。磁場調節依靠電路板上的旋鈕式電位器，通過轉動旋鈕可改變輸出電壓的大小進而改變磁場的大小。磁場強度太小或太大時，磁珠都不能按照既定的軌跡運動。同時，考慮到血漿獲取的不易性以及后續整機調試和故障維修等情況都可能會改變設定好的磁場，因而非常有必要對檢測模塊在無血漿（即只有磁珠的空杯子）時，對磁珠的運動狀態進行觀察研究并分析總結規律，為血凝儀后續整機組裝和調試提供依據和參考。

實驗中鋼珠運動位置示意圖如圖11所示。電機以向前90o再向后60o的方式轉動，偏心軸在圖11中表現為位置變化從1-4-2-5-3-6-4-7，以此類推。現將磁場調節實驗結果分成三種情況。

圖11 鋼珠運動位置示意圖Fig.11 Schematic diagram of steel ball’s movement position

首先，施加磁場強度大小剛好，命名此磁場為A。當電機以向前90o向后60o的方式轉動時，在加入血漿的實驗中，磁場A條件下（其實際線圈通電電流為0.40 A），磁珠可以按照電機運動的方式運動；在無血漿實驗測試中，磁珠滯后于電機的旋轉運動，如圖12中所示。磁珠受磁場力拖動，向前運動了約3/4圈到1圈后，向后運動約1/5圈，向后運動是因為電機轉一圈后，磁場力使得磁珠減速并反向運動，偏心軸位置與磁珠重合后繼續向前。

其次，施加磁場強度過小，稱此磁場為B。磁珠滯后于電機的旋轉運動，磁珠有向前和向后的運動，如圖13中所示。當磁珠與偏心軸在所示平面內處于同一直徑上時（比如位置1與位置7，位置2與位置8等），為臨界位置。在臨界位置之前，磁珠受力向前運動，過了臨界位置，受力方向相反，阻礙原來的運動，整體上只有些許向前運動，等到電機轉動一圈后又來到磁珠的位置，磁珠開始重復新一輪的向前向后運動。

圖12 磁場A條件下鋼珠運動一周的運動規律Fig.12 The movement pattern of steel ball in one cycle under the influence of magnetic field A

圖13 磁場B條件下鋼珠運動一周的運動規律Fig.13 The movement pattern of steel ball in one cycle under the influence of magnetic field B

最后，施加磁場強度過大，稱此磁場為C。電機以向前90o向后60o的方式轉動時，磁珠滯后于電機的旋轉運動，如圖14中所示。由于杯底光滑，磁珠依靠磁場力及慣性向前運動但沒有保留電機向后的運動信息，即減速時間不足以使磁珠反向運動，磁珠整體表現為以忽快忽慢的速度沿杯底軌跡運動。

以上三種磁場強度情況下磁珠運動的方式具有一定的特征和代表性，在血凝儀整機集成、調試或售后維修中，可以通過觀察在無血漿時空杯子中磁珠的運動狀態是否滿足磁場強度A中的現象進而來判斷故障是否是由于磁場強度引起的。如果出現同磁場B或C情況下類似的運動現象，可以通過旋鈕式電位器將磁場相應的調大或調小，從而快速地完成對檢測模塊的調試和校準。

3.2 APTT測試結果

通過血漿活化部分凝血活酶時間(APTT)測試檢測杯內樣本總的凝血狀況。如施加磁場強度過大或過小時，APTT測試的結果呈現不規律波動，如圖15所示。

圖14 磁場C條件下鋼珠運動一周的運動規律Fig.14 The movement pattern of steel ball in one cycle under the influence of magnetic field C

圖15 模塊的磁場未調節好時APTT測試呈現不規律結果Fig.15 APTT test partial results when the applied magnetic field is not proper

當施加磁場強度大小剛好時，如圖16(a)所示為初始測量時的波形圖，在加入凝血激活試劑后，開始凝血測試時，磁珠跟隨電機轉動而轉動，此時檢測線圈沒有顯著的磁通量變化，感應信號大體保持穩定。而當纖維蛋白原被水解為可溶性纖維蛋白單體而纖維蛋白單體交聯形成不溶性纖維蛋白細絲時，血漿的粘度增大，磁珠在血漿中受阻力增大，其運動狀態有所變化，感應信號有所減少，就會產生圖16(b)所示呈規律性的起伏波動，反映為在一定角度內來回擺動，其實質為磁場力不足以帶動磁珠按規定方式轉動，產生了信號衰減，當電機再次轉動到磁珠的位置處時，信號再次達到最大，如此反復，當纖維蛋白完全形成，即凝血完全反應，磁珠完全靜止，將不再有感應信號產生。當連續檢測到三次信號變化時，將第一次信號變化對應的時間確定為凝固時間。

APTT測試結果均值為36.4 s，在APTT參考范圍32～43 s之內，表明本研究所用方法及設計的檢測模塊滿足血凝儀檢測的基本需求。

圖16 磁場調節好后，APTT測試部分結果Fig.16 APTT test partial results after magnetic field adjustment

4 總結

本團隊在對血凝儀國內外現狀分析、各種凝血檢測方法深度調研研究以及對多種血凝儀專利進行深度分析的基礎上，對傳統磁珠法進行改進，設計出一種基于雙磁路磁珠法的血凝檢測方法并開發了使用此方法的血凝檢測模塊。所用的檢測方法與光學法濁度檢測方法相比，將不受黃疸、溶血、脂血等特異性血漿的影響；相較已有的傳統雙磁路磁珠法，所提方法在不脫離粘度檢測原理的前提下，將線圈減少為置于檢測杯杯底的驅動和檢測兩個線圈，既減少了雙磁路磁珠法的硬件成本，也使雙磁路磁珠法的結構更為簡單緊湊，此外，方案中對檢測杯也進行了改進，使其面對兩種甚至兩種以上檢測方法時的結構適應性得到增強，由于檢測杯四周沒有線圈阻礙，方案中利用機械傳動可實現多個或者某一排檢測杯逐一檢測。設計的檢測模塊對血漿APTT測試的結果均值為36.4 s，處于APTT參考范圍之內，實驗測試結果初步驗證了方法的有效性和所開發血凝檢測模塊的部分性能，可為新型血凝儀的設計和研發提供參考和依據。