抗菌型膽道支架的研究進展

劉文靜 ，李超婧 ，戚曉升，王程毅，關國平,王富軍,,王璐,

1 東華大學紡織學院，上海市，201620

2 東華大學紡織面料技術教育部重點實驗室，上海市，201620

3 上海交通大學附屬第一人民醫院，上海市，201620

4 東華大學產業用紡織品教育部工程研究中心，上海市，201620

5 東華大學紡織行業生物醫用紡織材料與技術重點實驗室，上海市，201620

0 引言

膽道是肝向十二指腸運送膽汁的管道，由肝內膽道和肝外膽道組成。膽道狹窄的表現為膽道壁纖維組織增生、管壁變厚、膽道內腔逐漸縮窄，主要病癥為黃疸，其次為肝功能失代償、膽道硬化及化膿性膽道炎等，內鏡逆行胰膽道造影術（ERCP）介入膽道支架是治療膽道狹窄、膽道梗阻的有效手段之一[1]。目前臨床使用的膽道支架包括塑料（PS）和自膨式金屬支架（SEMS），金屬支架可分為金屬裸支架、部分覆膜支架和全覆膜支架，其常見材料如圖1所示。

內鏡下膽道支架植入術在臨床上用于膽道狹窄的治療已相對成熟，但支架植入后的并發癥依舊是一項巨大的挑戰。支架植入后的常見并發癥有支架故障、支架移位、支架阻塞、支架穿孔以及膽道感染等[2]。

圖1 膽道支架常見材料分類Fig.1 Classification of common materials for biliary stents

1 膽道支架抗菌的必要性

1.1 細菌入侵的機制

由于膽道特殊的結構和生理機制，Oddi括約肌的收縮功能可防止腸道內容物回流到膽道，膽汁的流動可周期性地沖刷膽道系統使微生物難以定殖，膽汁中具有抗菌特性的膽汁鹽和免疫球蛋白，因此正常的膽道系統處于無菌環境。膽道系統易感性轉變及對周圍環境病原微生物防御機制的下降是引發膽道感染的主要原因，常見誘因是細菌從小腸上行進入膽道，細菌通過腸壁移位、血行播散以及門靜脈血液的細菌污染。膽道感染通常由腸道細菌引起，80%以上的膽道感染患者膽汁培養呈陽性[3]。革蘭氏陰性菌是引發膽道感染最常見的細菌，前三位分別為大腸桿菌（25%～50%）、克雷伯氏菌（15%～20%）和腸桿菌（5%～10%)，革蘭氏陽性細菌中腸球菌（10%～20%）最常見，在混合感染的患者膽道內還分離出少量厭氧菌（5%～10%）[4]。

1.2 細菌入侵的后果

1.2.1 膽道感染

一項回顧性研究表明，接受膽道支架植入術的患者在術后3周到31個月內發生膽道感染的概率高達25.5%，膽道感染使患者發生膽道再狹窄的概率從2.3%增加到13.1%。膽道感染的臨床常見癥狀有右上腹痛、發熱伴寒顫及黃疸，臨床判斷標準為患者首次通過ERCP放置膽道支架，術后反復發作寒戰高熱（＞38 ℃），血常規檢驗白細胞計數增高，膽汁細菌培養呈陽性，有超聲或CT等影像學診斷支持并伴發常見的臨床癥狀[5]。

1.2.2 支架堵塞

目前普遍認為細菌粘附、生物膜形成和膽泥淤積是支架堵塞的主要發病機制，支架表面膽汁污泥形成過程，如圖2所示。蛋白等物質首先被吸附在支架表面，繼而誘發細菌在支架表面定殖，最后形成膽汁污泥，引發支架堵塞。LEUNG等[6]用含菌膽汁和無菌膽汁灌注膽道支架，實驗觀察到被含菌膽汁灌注的支架表面上有一層致密的細菌和無定形物質層，而采用無菌膽汁灌注的支架表面未觀察到這種現象。膽泥淤積由蛋白質吸附和細菌粘附引發，大腸桿菌和腸球菌都具有粘附蛋白質的傾向，能促進細菌大量繁殖和晶體析出，最后由膽紅素鈣、棕櫚酸鈣、膽固醇晶體等物質堆積成污泥，并且在生物膜的基質中還可發現某些返流食物殘渣[7]，膽汁污泥最終導致導管阻塞。當前處理由污泥淤積造成的支架再狹窄的醫學技術包括在清除污泥的同時更換支架，或在再狹窄的支架內植入一個新的支架。

圖2 膽汁污泥形成機理Fig.2 Mechanism of bile sludge formation

2 殺菌型膽道支架

根據抗菌機理的差異，可將材料表面分為以殺滅細菌為目的的主動抗菌表面和以抑制細菌粘附為目的的被動抗菌表面以及兩者相結合的抗菌表面。主動抗菌表面是通過結合有效的抗菌物質例如抗生素、有機季銨鹽、銀離子、殼聚糖等來構建主動攻擊的抗菌表面。

2.1 有機抗菌劑

有機抗菌劑具有殺菌效率高的特點，其對微生物的破壞機理分為三類：破壞細胞壁和細胞膜系統；破壞體內的蛋白酶或其他活性物質；影響遺傳基因[8]。目前用于膽道支架抗菌改性的有機抗菌劑主要包括三氯生、季銨鹽類、抗生素類等。

余海亮等[9]研究了不同濃度的三氯生的抑菌效果，并與同濃度的左氧氟沙星和聯合紫杉醇的三氯生進行比較。抑菌環實驗顯示不同濃度的三氯生對于細菌均有明顯的抑制作用且優于同濃度的左氧氟沙星和聯合紫杉醇組。將三氯生涂層通過旋涂的方式負載到316L醫用不銹鋼，在體外人膽汁浸泡環境下，三氯生藥物涂層組表面吸附的細菌量及吸附的層粘連蛋白均明顯少于裸材料組，表明三氯生適用于膽道感染性疾病。使用直接涂層的方式抗菌藥物難以達到持續抗菌效果，無法滿足理想抗菌膽道支架的需求。OBERMEIER等[10]以聚乳酸為藥物載體包覆三種不同類型的有機抗菌劑對膽道塑料支架進行抗菌改性并評價其抗菌效果，涂層中分別包含奧替尼啶（RO）、奧替尼啶和檸檬酸（ROC）、三氯生（RT）、慶大霉素（RG），在所有抗菌支架涂層中觀察到藥物連續釋放至少168 h并在前24 h內達到初始峰值。RT、ROC和RG涂層的支架導致大腸桿菌、糞腸球菌和白色念珠菌的細菌懸液中的細菌數量呈對數下降，其中ROC的抗菌及持續抗菌效果最好且與預防術后膽道炎的理想抗菌膽道支架所需的性能相符。

2.2 無機抗菌劑

無機抗菌劑包含金屬型抗菌劑和光催化型抗菌劑，用于膽道支架抗菌的無機抗菌劑多為具有廣譜殺菌功能和低毒性的銀離子抗菌劑，納米銀顆粒（NP）在對人細胞無毒的濃度下可表現出高殺菌活性[11]。

LEUNG[12]首次對聚氨酯膽道支架進行鍍銀改性，與對照組相比鍍銀表面貼壁細菌的數量減少了10～100倍，為納米銀引入膽道支架領域提供了基礎。之后多項研究采用化學還原法[13-14]和靜電吸附法[15]在聚氨酯支架或聚四氟乙烯支架表面沉積納米銀涂層，結果均表明納米銀可有效抑制細菌在支架表面的粘附。為使銀離子緩慢釋放，楊富春等[16]采用液相化學還原法，以聚乙烯塑料膽道支架為載體，通過殼聚糖復合銀納米離子和肝素層層組裝，涂層厚度小于1 μm且銀離子緩釋性好，體內實驗顯示含銀支架能顯著延長膽道系統的通暢期并提高臨床研究存活率，為膽道狹窄的治療策略提供了新方法。

針對金屬膽道支架的抗菌改性，LEE等[17]在覆膜膽道金屬支架的有機硅膜中添加粒徑為250 nm的銀離子制備抗菌型膽道支架，支架內壁生物膜厚度較對照組的10.62 μm降低為3.32 μm，對手術部位組織的炎癥反應也有明顯的抑制效果。該課題組后續跟蹤研究了含銀離子的膽道支架產品（ABC Stent,M.I.Tech,Seoul,Korea）對惡性遠端膽道梗阻的療效和安全性，銀離子支架的中位通暢天數為179，而同期不含銀離子支架的中位通暢天數為116.5，表明抗菌型銀離子支架能抑制細菌生物膜的形成并提高支架的通暢時間[18]。

2.3 天然抗菌劑

天然抗菌劑具備安全、低毒、副作用小的優勢，殼聚糖是目前廣泛使用的天然抗菌劑，抗菌機理可能是殼聚糖的聚陽離子特性會干擾細菌表面的負電荷，殼聚糖與細胞膜之間的相互作用會通過停止細菌的代謝而改變細菌的通透性或抑制細菌的生長，但殼聚糖抗菌能力有限和僅在酸性條件下抗菌的缺點也限制了其應用[19]。

LIN等[20]用甲醇沉淀技術將殼聚糖沉積在氧化的聚乙烯支架管內表面后細菌粘附量明顯增多，將其歸因于殼聚糖改性后表面增加的粗糙度和正電荷以及PBS和膽汁偏堿性的環境。單獨的殼聚糖涂層的抗菌及抗細菌粘附功能并不理想，BRATSKAYA等[21]通過殼聚糖/k-角叉菜膠多層堆積和馬來酸酐共價接枝殼聚糖的方式對材料表面進行改性，針對從堵塞的膽道支架中分離出的兩種糞腸球菌進行抗細菌粘附和殺菌能力評價，在兩種類型的殼聚糖涂層上均觀察到初始粘附率以及1 h后粘附細菌的數量均下降，其中多層膜的抗細菌粘附性能優于共價接枝殼聚糖層，高度水合的殼聚糖/k-角叉菜膠多層涂層在抗生物粘附的應用中具有可觀的前景。

3 抗細菌粘附型膽道支架

被動防御表面雖然不具備殺菌功能，但可通過調控材料表面的浸潤性來實現細菌防粘連。研究人員已經開發出被動防御抗菌表面，通過制造具有親水或疏水特性的表面來實現細菌抗粘附。對膽道支架表面進行親水或疏水改性對生物膜的形成及膽泥的淤積提供了一種新的思路。

3.1 親水型

親水型表面防細菌粘附的機理可能是親水基團吸附水分子產生位阻效應，抑制細菌在材料表面粘附，目前膽道支架的親水改性主要集中于塑料支架。已有研究證明使用親水型材料制備的膽道支架或對膽道支架進行親水改性可抑制細菌在支架表面的粘附和生物膜的生長。

Vivathane是一種表面超光滑的親水型高分子材料，將Vivathane制成的支架在接受含細菌的膽汁灌注后支架表面沒有細菌粘附也沒有膽泥沉積的傾向，而常規的支架表面出現了旺盛的細菌生長和膽汁淤積[22]。

關于膽道支架親水改性的研究已有近30年的歷史，親水改性包括表面親水涂層改性、親水基團改性、結構改性等。JANSEN等[23]將親水聚合物涂層的聚氨酯膽道支架與未涂層聚氨酯支架對比，靜態細菌粘附實驗和動態磷酸鹽緩沖液及膽汁灌注實驗結果均表明親水改性涂層對于細菌的粘附有抑制作用。KWON等[24]通過雙層涂層的方法在聚乙烯支架和聚氨酯支架的底層使用高粘度涂層，頂層使用高度潤滑涂層構建親水性涂層，加強涂層的耐久性和均勻性。與未涂層支架相比，涂層支架在8周時生物膜形成和管腔狹窄更少。PENG等[25]使用發煙硫酸對聚乙烯膽道支架表面進行磺化基團改性，改善支架表面的親水性和光滑度。經過48 h膽汁灌注后，大腸桿菌在磺化支架表面的粘附率比未改性支架低10～20倍。SEKIGUCHI等[26]受蝸牛殼的啟發，用電子束光刻在Si基底上形成了200 nm的納米級別的微小凸起，當水進入納米凸起的空隙時就會形成一層具有超納米親水結構的水膜，制備內表面具有仿蝸牛殼微結構的膽道支架，動物實驗顯示這種納米結構的支架具有出色的防污性能。

親水型支架具有出色的防污性能推進了膽道支架的發展，但也有部分臨床數據顯示親水改性的膽道支架對提高支架的通暢時間方面未發現明顯的優勢[27-28]，可能原因是支架的親水型涂層容易被破壞，細菌粘附后對涂層功能的影響導致涂層失去抗粘附的功能，涂層的耐久性差導致其抗細菌粘附的效果不持久[28]。

3.2 疏水型

疏水型表面由于其出色的自清潔功能在細菌的防粘附領域已有廣泛的應用，其抗粘附原理是由于支架表面具有與荷葉表面相似的微納粗糙結構，能防止細菌的附著。超疏水表面用于膽道防細菌粘附的研究較少，主要是在植入過程和在體內膽道環境中其粗糙表面容易磨損，失去疏水功能。

SEITZ等[29]采用有機環氧化合物和無機硅烷通過有機-無機溶膠-凝膠法在聚四氟乙烯支架表面進行疏水改性，添加不含或含氟硅烷的丙基氨基硅烷調節疏水性。疏水改性后的支架表面的膽泥沉積量少于對照組，但是添加氟氨基硅烷增加表面的疏水性會導致污泥的粘附性增加。WEICKERT等[30]使用疏水蛋白以及疏水蛋白和抗生素或肝素的組合對塑料支架進行改性，體外膽汁灌注實驗結果顯示用疏水蛋白涂覆塑料支架可減少支架表面細菌粘附的數量，肝素的加入可進一步降低細菌的粘附，但是抗生素的加入沒有進一步減少細菌的粘附。在之后的體內實驗中[31]，在自膨式膽道支架表面涂覆疏水蛋白或疏水蛋白和肝素涂層結果卻顯示與未涂層支架的效果沒有差異，分析原因可能是體內膽道環境中十二指腸返流或實驗時間較短通暢優勢還未凸顯。

此外，也有學者受自然界中表面覆蓋有滑液的豬籠草的啟發，開發了一種能抑制細菌及污垢粘附的注液型光滑表面（SLIPS）[32]，研究表明這種光滑型表面對銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的防粘附率分別達到99.6%、97.2%及96%[33]。在膽道支架內壁進行改性制備超光滑表面也為膽道支架抗膽泥淤積提供了新的思路。

4 小結與展望

細菌是膽道支架感染及再堵塞的重要誘因，開發理想的抗菌型膽道支架具有重要意義，目前所研究的抗菌型膽道支架各有優勢與不足。主動抗菌型膽道支架雖然具有顯著的抗菌效果，但是死去的細菌會粘附抗菌活性位點，抑制其抗菌性能。將抗菌劑直接涂覆于支架表面，抗菌效果也無法持久，抗菌劑負載于可降解緩釋載體或采用其他緩釋抗菌方式可達到長效抗菌功效。被動抗菌雖無法直接殺死細菌，但是可從源頭抑制細菌的粘附。目前研究的親水型和疏水型支架為抗菌型膽道支架提供了另一條思路，但是親水型和疏水型支架在使用過程中其表面容易被破壞或者由于粗糙度的增大，抗粘附效果仍不理想。兩種抗菌方式結合的膽道支架可以達到雙贏的效果，但是目前殺菌和抗粘附結合的膽道支架研究的較少。結合膽道的特殊環境，制備具有長效殺菌和抑制細菌粘附，符合生物安全性和臨床使用需求的膽道支架，仍需要深入的研究。