柚皮苷調(diào)控PI3K/Akt/eNOS通路控制2型糖尿病大鼠腦血管內(nèi)皮氧化損傷的作用探討

郭芬，王曉雪

作者單位：河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院，a老年科，b老年神經(jīng)內(nèi)科，河南 開封475000

活性氧（ROS）過量生成可增加糖尿病相關(guān)血管并發(fā)疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。柚皮苷（Naringin）具有抗氧化、清除自由基的特性。此外，柚皮苷具有抗炎、抗凋亡、抗癌和心臟保護(hù)作用。最近，有研究報(bào)道，柚皮苷（Naringin）對(duì)糖尿病及其潛在并發(fā)癥具有一定的治療作用。柚皮苷的作用機(jī)制涉及抑制炎癥、氧化應(yīng)激損傷、糖代謝酶異常等方面，并且可在一定程度上延緩糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展。然而，柚皮苷在治療2型糖尿病方面的分子機(jī)制仍有待闡明。

3-磷酸肌醇激酶（PI3K）是肌醇與磷脂酰肌醇的重要激酶，PI3K 家族成員屬于原癌基因。在PI3K家族中，PI3K 可通過與具有磷酸化酪氨酸殘基的生長因子受體或連接蛋白相互作用導(dǎo)致二聚體構(gòu)象改變而被激活。PI3K激活后可以磷酸化蛋白激酶B（AKT）并導(dǎo)致Akt 信號(hào)通路激活。Akt 信號(hào)通路激活后可磷酸化內(nèi)皮型一氧化氮（eNOS）并調(diào)節(jié)eNOS 活性。eNOS 的活化可進(jìn)一步促進(jìn)一氧化氮（NO）的釋放并發(fā)揮血管保護(hù)作用。因此，PI3K/Akt/eNOS 信號(hào)通路在2 型糖尿病發(fā)病過程中，尤其是在血管內(nèi)皮氧化損傷方面，具有重要作用。因此，2019年3月15 日至2020年5月20 日，本研究旨在探討柚皮苷對(duì)2型糖尿病大鼠腦血管內(nèi)皮氧化損傷的影響。本研究符合一般動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)原則。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

將80只6周齡清潔級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量范圍120～150 g，購自南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)SYXK（豫）2019-0002，飼養(yǎng)在25 ℃、55%濕度、照明條件為12 h光暗循環(huán)的環(huán)境中。

1.2 動(dòng)物分組及建模

將大鼠按隨機(jī)字母表法分為對(duì)照組、模型組、柚皮苷組、柚皮苷+LY294002 組（n=20）。對(duì)照組大鼠給予標(biāo)準(zhǔn)飼料，其他組大鼠給予高糖高脂飼料（20%蔗糖、10%豬油和2.5%蛋黃），共喂養(yǎng)4周。禁食12 h后，對(duì)模型組、柚皮苷組和柚皮苷+LY294002組大鼠腹腔注射60 mg/kg 的鏈脲佐菌素（STZ，美國Sigma 公司）建立2 型糖尿病模型；對(duì)照組大鼠注射等體積的生理鹽水。1 周后收集大鼠尾靜脈血并測空腹血糖值（FBG），F(xiàn)BG＞16.7 mmol/L 且伴有多飲、多食、多尿、胰島素水平升高則表示造模成功。各組大鼠繼續(xù)喂養(yǎng)8周，柚皮苷組大鼠灌胃100 mg/kg 的柚皮苷溶液，柚皮苷+LY294002 組大鼠在灌胃100 mg/kg 的柚皮苷溶液的基礎(chǔ)上，加用腹腔注射給予100 mg/kg 的PI3K 抑制劑LY294002[凱梅根（上海）生物科技有限公司］，其他組大鼠灌胃等體積的生理鹽水。

1.3 標(biāo)本收集

收集大鼠血清用于檢測血糖、血脂水平。麻醉大鼠（10%水合氯醛）并取出腦組織，一部分腦組織以液氮固定4 h，并在-80 ℃冷藏，用于氧化損傷相關(guān)指標(biāo)檢測及Western blotting，另一部分常規(guī)制作切片，用于HE染色。

1.4 生化指標(biāo)檢測

強(qiáng)生穩(wěn)步倍加型血糖儀檢測大鼠血糖水平。日立7600 全自動(dòng)生化分析儀檢測總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平。采用硝酸還原酶法檢測各組大鼠血清NO 水平，檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.5 蘇木精

-

伊紅（HE）染色

使用切片機(jī)對(duì)大鼠腦組織進(jìn)行切片，按照試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）說明對(duì)腦組織進(jìn)行HE染色。

1.6 氧化應(yīng)激指標(biāo)的檢測

將各組大鼠腦組織進(jìn)行勻漿，按照南京建成生物工程研究所的試劑盒測定丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）水平。

1.7 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）

將大鼠腦組織裂解，通過BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。SDS-PAGE上分離蛋白，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜[伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司］，5%脫脂牛奶（完達(dá)山乳業(yè)股份有限公司）封閉1 h。將膜在4 ℃下與以下一抗過夜孵育：3-磷酸肌醇激酶（PI3K）、磷酸化-PI3K（p-PI3K）、蛋白激酶B（AKT）、磷酸化-AKT（p-AKT）內(nèi)皮型一氧化氮（eNOS）、磷酸化-eNOS（p-eNOS）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）（1∶1 000）。抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司。將膜在室溫下與山羊抗兔二抗（美國Bio-world 公司，1∶3 000）孵育1 h。通過超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影。GAPDH作為內(nèi)部對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 柚皮苷對(duì)2 型糖尿病大鼠血糖和血脂代謝指標(biāo)的影響

與模型組比較，柚皮苷組的空腹血糖、TC、TG 和LDL-C 水平均顯著降低，而HDL-C 水平顯著升高。與柚皮苷組比較，柚皮苷+LY294002 組的空腹血糖、TC、TG 和LDL-C 水平均顯著升高，而HDL-C水平顯著降低。見表1。

表1 SD大鼠80例的血糖和血脂代謝指標(biāo)水平/（mmol/L，±s）

2.2 柚皮苷對(duì)2 型糖尿病大鼠腦組織病理變化的影響

對(duì)照組大鼠腦皮層區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)完整，海馬齒狀回細(xì)胞排列整齊。模型組大鼠大腦皮層區(qū)發(fā)生明顯的神經(jīng)元變性、壞死，海馬齒狀回神經(jīng)細(xì)胞核固縮、深染、變形、細(xì)胞排列紊亂。柚皮苷組的上述組織病理改變均明顯減輕。而柚皮苷+LY294002 組的神經(jīng)元細(xì)胞變性、核固縮、細(xì)胞排列紊亂等病變較柚皮苷組加重。見圖1。

圖1 2型糖尿病大鼠腦組織病理變化比較（HE染色×200）

2.3 柚皮苷對(duì)2 型糖尿病大鼠血清一氧化氮（NO）水平的影響

與對(duì)照組比較（34.54±2.65）μmol/L，模型組大鼠的血清NO 水平（19.11±1.47）μmol/L 顯著降低（

t

=21.743，

P

=0.001）。與模型組比較，柚皮苷組的血清NO 水平（28.76±2.21）μmol/L 顯著升高（

t

=17.332，

P

=0.003）。然而，與柚皮苷組比較，柚皮苷+LY294002 組的血清NO 水平（24.19±1.86）μmol/L顯著降低（

t

=11.421，

P

=0.012）。

2.4 柚皮苷對(duì)2 型糖尿病大鼠腦組織氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

與對(duì)照組比較，模型組大鼠的SOD 水平顯著降低[（63.54±4.88）U/mgprot 比（41.22±3.17）U/mgprot，

t

=14.378，

P

=0.004］，而MDA 水平顯著升高；對(duì)照組MDA 低于模型組[（4.13±0.31）nmol/mgprot比（9.37±0.72）nmol/mgprot，

t

=27.322，

P

=0.001］。與模型組比較，柚皮苷組的SOD 水平為（55.17±4.24）U/mgprot 顯著升高（

t

=12.489，

P

=0.008），而MDA 水平為（6.28±0.48）nmol/mgprot 顯著降低（

t

=18.997，

P

=0.001）。然而，與柚皮苷組比較，柚皮苷+LY294002組的SOD 水平（46.89±3.60）U/mgprot 顯著降低（

t

=21.545，

P

=0.011），而MDA 水平（7.15±0.55）nmol/mgprot顯著升高（

t

=15.224，

P

=0.017）。

2.5 柚皮苷對(duì)2 型糖尿病大鼠腦組織PI3K/Akt/eNOS 信號(hào)通路的影響

與模型組比較，柚皮苷組的PI3K、p-Akt 和p-eNOS 水平顯著升高，與柚皮苷組比較，柚皮苷+LY294002 組的PI3K、p-Akt 和peNOS 水平顯著降低。見表2，圖2。

圖2 Western blotting檢測各組大鼠腦組織相關(guān)表達(dá)：A為PI3K，B為Akt，C為eNOS的

3 討論

據(jù)報(bào)道，高葡萄糖導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞中過量生成活性氧（ROS）。過量的ROS形成影響缺氧信號(hào)通路并進(jìn)一步加重血管內(nèi)皮障礙。柚皮苷具有抗癌、抗炎、抗氧化及其他多種生物活性。應(yīng)用不同劑量的柚皮苷（20、40 和80 mg/kg）治療糖尿病大鼠，發(fā)現(xiàn)柚皮苷以劑量依賴性方式顯著減少糖基化血紅蛋白并改善胰島素分泌，表明柚皮苷具有劑量依賴性降血糖作用。在柚皮苷和維生素C聯(lián)合治療STZ 誘導(dǎo)的Wistar 大鼠過程中，有研究者發(fā)現(xiàn)該治療有效地改善了血糖和糖基化血紅蛋白，增加了肝臟和腎臟己糖激酶活性，減少了葡萄糖6 磷酸酶和果糖16-二磷酸活性，減少脂質(zhì)過氧化物的堆積，并增加了谷胱甘肽的合成。Ali等報(bào)道柚皮苷治療STZ 誘導(dǎo)大鼠可顯著降低血糖、過氧化氫和硫代巴比妥酸水平，同時(shí)增加胰島素水平和抗氧化酶活性，從而導(dǎo)致抗氧化能力的總體提高。因此，柚皮苷的抗高血糖作用和抗氧化應(yīng)激作用可能在治療糖尿病及相關(guān)并發(fā)癥方面具有較高價(jià)值。本研究證實(shí)了柚皮苷的良好的抗氧化作用。

表2 各組大鼠腦組織中PI3K、p-AKT/total-AKT和p-eNOS/total-eNOS的蛋白相對(duì)表達(dá)量

研究表明，血管內(nèi)皮細(xì)胞可分泌多種血管活性物質(zhì)，其中包括血管舒張因子NO。研究顯示，糖尿病患者因發(fā)生血管內(nèi)皮功能受損可導(dǎo)致NO 合成被抑制。此外，高血糖條件可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能顯著降低，并降低NO 生物利用度。此外，高血糖培養(yǎng)條件會(huì)加速血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老，導(dǎo)致增殖活性受損。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠的血清NO 水平顯著降低，而柚皮苷治療顯著升高了大鼠血清NO水平。提示，柚皮苷的治療作用可能與調(diào)節(jié)NO 的合成和分泌有關(guān)。

其他研究者發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKT/eNOS 信號(hào)通路受到抑制可引起血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂，當(dāng)eNOS 活性下降時(shí)，導(dǎo)致NO 合成減少。eNOS 活性的增強(qiáng)主要由PI3K/AKT 信號(hào)通路介導(dǎo)。本研究發(fā)現(xiàn)，柚皮苷治療顯著上調(diào)了PI3K 的表達(dá)并激活了PI3K/AKT/eNOS 信號(hào)通路，因此柚皮苷發(fā)揮了PI3K激動(dòng)劑的作用。為了確定PI3K/AKT/eNOS 信號(hào)通路在柚皮苷治療過程中的作用，本研究設(shè)置了柚皮苷+LY294002 組，該組大鼠在柚皮苷基礎(chǔ)上應(yīng)用PI3K 抑制劑LY294002 處理大鼠，發(fā)現(xiàn)LY294002 處理抑制了PI3K/AKT/eNOS 信號(hào)通路，并且可明顯減弱柚皮苷對(duì)2型糖尿病大鼠的治療作用。

綜上所述，柚皮苷對(duì)2 型糖尿病大鼠的腦保護(hù)作用主要由PI3K/AKT/eNOS信號(hào)通路介導(dǎo)。