早產兒出生后4周內腸道微生物的產氣差異

王雪芳李娟朱立穎尹迪張華婷李娜龔小慧胡勇△

（1上海交通大學附屬兒童醫院，上海市兒童醫院新生兒科上海200062；2浙江省農業科學院植物保護與微生物研究所-農產品質量安全危險因子和風險防控國家重點實驗室（籌）杭州310021）

嬰兒胃腸道的微生物定植是人類生命周期中的一個重要過程，因為微生物群和宿主建立的相互作用對人類健康和疾病具有重要影響。傳統上，人們認為出生時腸道是無菌的［1］，很快被來自母體和周圍環境的微生物定植，此理論依據是不能從羊水或嬰兒的皮膚表面培養細菌。然而，隨著16SRNA測序技術的出現，一些研究表明，健康宿主的胎糞實際上不是無菌的，腸道定植開始于出生前［2-4］，4～6個月時達到成年人的水平，1歲以后腸道菌群的種類趨于穩定。與足月兒相比，早產兒的腸道細菌定植模式被描述為延遲和異常［5］。在生命的最初幾周，異常的腸道定植可能改變宿主微生物群的屏障、營養和免疫功能，從而增加對疾病的易感性［6-7］。其中，腹脹為新生兒期常見癥狀之一，也是危重患兒病情惡化的征兆，尤其多見于早產兒。新生兒腹脹以氣腹多見，如新生兒壞死性小腸結腸炎、乳糖不耐受等疾病相關臨床表現與氣體的大量產生密切相關。已被證實，腸道內大部分氣體不是由人類宿主產生的，而是腸道微生物發酵后的產物［8］，這些氣體包括二氧化碳、氫氣、甲烷和硫化氫［9］。目前已有研究者報道成年人腸道氣體經肛門的排泄率為1.48 mL/min，經肛門所排出氣體的主要組分為氮氣（59%），氫氣（20.9%），二氧化碳（9%），甲烷（7.2%），氧氣（3.9%）和硫化氫（0.000 28%）［10-11］，而新生兒腸道微生物的產氣量及各種氣體所占的比例暫未見報道。

目前腸道發酵氣體常用的檢測設備是呼吸氣體測定儀，其檢測到的氣體組成及所占比例更接近于胃內氣體的組成成分，該儀器主要用于診斷小腸部分細菌的過度生長和過度發酵［12-13］。而對結腸部位細菌活性產生氣體的檢測目前除了檢測屁的組成成分［11］，沒有可靠的方案和設備，特別是對新生兒這類無法應用呼吸氣體測定儀、不便收集經肛門排出的氣體的研究對象。本實驗所應用的國內首創的體外發酵模型與氣體分析儀，是直接將受試者的糞便懸液接種于培養基中進行體外發酵，從而檢測氣體成分，更能準確地檢測出受試者結腸部位微生物所產氣體的含量、組成成分及各成分所占比例。與呼吸氣體測定儀相比，本技術可適用人群較廣，且所測氣體的相關數值更接近于結腸部位的氣體產量及組成成分。相對于屁的成分的檢測，本技術所產生的誤差較小，且更方便進行。

本文納入處于新生兒期的早產兒，研究其出生后不同日齡時腸道微生物的產氣量及二氧化碳、氫氣、甲烷、硫化氫所占比例，希望對新生兒壞死性小腸結腸炎、乳糖不耐受等疾病的病理機制研究提供新的思路和方法。

資料和方法

納入/排除標準納入標準：出生時胎齡≥28周且＜37周，并獲得父母書面知情同意；排除標準：有畸形或代謝性疾病，或未獲得父母書面知情同意。

一般資料招募2020年5月1日—6月1日期間生后即入上海市兒童醫院治療的19名早產兒，被納入研究的早產兒均符合上述標準，另外納入12組不接種糞便的空白培養基作為對照。納入研究的早產兒的平均胎齡為31周（28+1周～36+3周），平均體重為1 385.5 g（850～2 040 g），其中男嬰12人、女嬰7人；10名是順產出生，9名是剖宮產出生（表1）。

表1 19名早產兒的出生情況Tab 1 Thebirth of 19 preterm infants

糞便樣本收集及處理在受試者出生的1個月內，采用常規糞便取樣盒分別在其生后3天內、1周、2周、3周、4周時刮取尿不濕表面新鮮糞便，用厭氧磷酸緩沖液（PBS）配制成質量濃度為100 g/L的糞便懸液，混勻后用0.125 mm的無菌金屬篩過濾除去大的食物殘渣，接種0.5 mL糞便懸液進入15 mL密封培養基中。實驗所采用的4種培養基為：培養基LAT（以乳糖為主要碳源）、培養基FOS（以低聚果糖為主要碳源）、培養基FL-2（以母乳低聚糖中的2’-巖藻糖基乳糖為主要碳源）和培養基GOS（以低聚半乳糖為主要碳源）。培養基其他共有組分包括：胰蛋白胨10 g/L；酵母提取物2.5 g/L；L-半胱氨酸1 g/L；血 紅 素2 mL/L；NaCl 0.9 g/L；CaCl2·6H2O 0.09 g/L；KH2PO40.45g/L；K2HPO40.45 g/L；MgSO4·7H2O 0.09 g/L；維生素I 200μL/L；刃天青（1 g/L）1 mL。維生素I溶液包括：生物素0.05 g/L，鈷胺素0.05 g/L，對氨基苯甲酸0.15 g/L，葉酸0.25 g/L，吡哆胺0.75 g/L。

體外發酵本研究采用批量發酵系統進行［14］。將500μL處理好的新鮮糞便接種液接種到培養基中，然后放置到37℃的恒溫培養箱中培養24 h。

氣體測量基于體外模擬平臺，批量液體培養腸道菌群，使其產生氣體，而后用腸道微生物發酵氣體分析儀檢測其產氣總量與二氧化碳、氫氣、甲烷和硫化氫所占比例。

統計學分析采用SPSS 24.0統計軟件對各組間產氣量、各種氣體所占比例進行統計學分析。計量資料不符合正態分布，以中位數（四分位間距）即M（P25，P75）表示，組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義，P＜0.01為差異有顯著統計學意義。

結 果

24小時產氣總量如圖1和表2所示，隨著日齡的增加，各培養基組總產氣量呈遞增趨勢，間接證明隨著早產兒日齡增加，腸道菌群的數量及多樣性增加。早產兒相同日齡下，培養基LAT、FOS、FL-2、GOS組間相比，培養基LAT組的產氣總量最大，培養基FL-2組產氣量最小。

表2 早產兒不同日齡下各培養基內產氣總量分布表Tab 2 Distribution of total gas production in different media of preterm infants at different ages ［mL，M（P25，P75）］

圖1 各組產氣總量差異圖Fig 1 Difference of total gas production among four media

二氧化碳所占比例如圖2和表3所示，在4種培養基中，早產兒出生后第2周時開始產生數量較多的二氧化碳，早產兒相同日齡下，培養基LAT、FOS、FL-2、GOS組間相比，培養基FL-2組產二氧化碳量最小。

圖2 各組二氧化碳所占比例差異圖Fig 2 The proportion difference of carbon dioxide among four media

表3 早產兒不同日齡下各培養基內二氧化碳所占比例分布表Tab 3 Distribution of carbon dioxide in different media of preterm infants at different ages ［%，M（P25，P75）］

甲烷所占比例如圖3和表4所示，在4種培養基中，空白對照組與早產兒出生后3天內、1周、2周、3周、4周時均檢測到了甲烷，培養基LAT、FOS、FL-2中檢測到甲烷的差異無統計學意義，培養基GOS中檢測到甲烷的差異有統計學意義。

氫氣所占比例如圖4和表5所示，在培養基LAT、FOS、FL-2、GOS中，均發現早產兒出生后第2周開始產生數量較多的氫氣。無論早產兒處于何種日齡，培養基LAT中產H2的量均最多，培養基FL-2中產氫氣的量均最少。

硫化氫所占比例如圖5和表6所示，在培養基LAT、FOS、FL-2、GOS中，均發現早產兒出生后第2周方才產生一定數量的硫化氫。無論早產兒處于何種日齡，培養基FL-2中產H2S的量均最少。

4種氣體所占比例的對比如圖6所示，早產兒出生后腸道微生物即可產生甲烷，但是，隨著早產兒日齡的增加，甲烷所占比例無明顯變化。早產兒出生后第2周，方才檢測出數量較多的二氧化碳、氫氣、硫化氫。早產兒出生后第2～4周時，這4種氣體所占比例的遞減排序均為：二氧化碳、氫氣、甲烷、硫化氫。

表4 早產兒不同日齡下各培養基內甲烷所占比例分布表Tab 4 Distribution of methane in different media of preterm infants at different ages［%，M（P25，P75）］

圖3 各組甲烷所占比例差異圖Fig 3 The proportion difference of methane in each medium

圖4 各組氫氣所占比例差異圖Fig 4 The proportion difference of hydrogen in each medium

討 論

既往研究通過檢測呼出氣體的成分，認為兒童3歲以前從未檢測到甲烷，隨著年齡增長，甲烷的產生也在增加，3歲和4歲兒童平均值為6.4%，直到10歲時達到成年分布［15-16］。然而，呼吸中不排出CH4的患者實際上可以在結腸氣體中存在甲烷［17］，Rutili等［18］在一名27個月的受試者中檢出了產甲烷菌。Dridi等［19］通 過 改 進 的DNA檢 測 證 實 了 產 甲 烷 菌M.smithii和M.stadtmanae在人類腸道中的高流行率，前者幾乎是腸道微生物群落中普遍存在的寄居者，其實驗的受試者年齡最小為1個月。

本研究利用體外發酵模擬平臺及氣體檢測儀檢測早產兒出生后4周內腸道微生物的產氣情況，結果顯示：空白對照組與早產兒出生后3天內、1周、2周、3周、4周時均檢測到甲烷的產生。然而，培養基LAT、FOS、FL-2中各組檢測到的甲烷的差異無統計學意義，培養基GOS中各組檢測到的甲烷的差異有統計學意義。由此可引出兩種假設：（1）早產兒出生后4周內腸道微生物也許即可經過發酵產生甲烷；（2）我們所檢測到的甲烷也許是培養基或是氣體分析儀的數據基線。為進一步排除培養基和氣體分析儀的問題，我們重新調試儀器，重新檢測了空白對照組，所測氣體數據均為0。但因本實驗所收集的標本已失效，無法再次進行氣體的檢測，我們重新留取了早產兒出生后4周內的糞便進行體外發酵和氣體檢測，仍可檢測到甲烷的產生，但因目前所納入的樣本量有限，無法得出準確結論。本實驗將繼續進行，并計劃利用16sRNA測序技術檢測早產兒出生后4周內的腸道菌群，以驗證早產兒出生后4周內腸道菌群中是否含有產甲烷菌，其腸道微生物是否可產生甲烷。

表5 早產兒不同日齡下各培養基內氫氣所占比例分布表Tab 5 Distribution of methane in different media of preterm infants at different ages［%，M（P25，P75）］

表6 早產兒不同日齡下各培養基內硫化氫所占比例分布表Tab 6 Distribution of hydrogen sulfide in different media of preterm infants at different ages ［%，M（P25，P75）］

圖5 各組硫化氫所占比例差異圖Fig 5 The proportion difference of hydrogen sulfide in each medium

氫氣是腸道菌群發酵的常見氣體產物，可通過3種方式消除：（1）通過屁從肛門排出；（2）吸收到系統循環和隨后的呼吸排泄；（3）通過結腸微生物代謝。目前認為腸道微生物的消耗是消除氫氣的主要方式［20］，腸道氫氣可以被腸道產甲烷菌用作代謝燃料來生產甲烷，而被乙酰乙酸和硫酸鹽還原生物用作生產硫化氫［21］。本研究于早產兒出生后第2周方才檢測到數量較多的氫氣，而無論早產兒處于何種日齡，培養基LAT中產氫氣的量均最多，說明在早產兒食物中添加乳糖會使腸道產氫氣量增加。氫氣呼出實驗作為乳糖不耐受的診斷方法之一，診斷原理就是通過測定呼出的氫氣水平反映乳糖的消化吸收狀況［22］，顯然，這種方法并不適用于新生兒。本研究所采用的體外發酵模擬平臺及氣體檢測儀，也許可成為研究乳糖不耐受的新手段。

硫化氫是一種刺激性有毒氣體，在結腸中由內源性和自然產生的硫酸鹽還原細菌產生，起著細胞保護和細胞毒性的作用［23-24］。越來越多的研究者提出硫化氫的產生增多與潰瘍性結腸炎也許存在關系，但目前尚無有力的證據［25-26］。本實驗結果顯示，早產兒出生后第2周可檢測到硫化氫，但并非所有的早產兒均可檢測到，且大部分早產兒產生量極少。有1例壞死性小腸結腸炎患兒被檢測到較多的硫化氫。硫化氫產生過多是否與新生兒壞死性小腸結腸炎之間存在一定的聯系，值得進一步研究。

圖6 各組甲烷、二氧化碳、氫氣、硫化氫所占比例差異圖Fig 6 Proportion difference of carbon dioxide，methane，hydrogen and hydrogen sulfide in each medium

通過培養基LAT、FOS、FL-2、GOS組間的對比，我們發現：無論受試者處于何種日齡，培養基FL-2中產氣總量均最少，而培養基LAT中產氣總量最多；培養基FL-2中二氧化碳、氫氣、硫化氫所占比例較少，在培養基LAT中較多，說明適當提高早產兒食物中母乳低聚糖的所占比例可減少早產兒腸道內氣體的產生，減少腹脹的發生，部分解釋了母乳喂養的好處。相比之下，若受試者結腸部位存在大量的乳糖，腸道內產氣將會增加，從而引發腹脹癥狀，與臨床上乳糖不耐受患兒常出現腹脹癥狀［27］的情況一致。同時，本實驗結果也許提示我們，乳糖不耐受患兒較正常新生兒腸道產氣中二氧化碳、氫氣、硫化氫的濃度明顯增高，而甲烷的濃度無明顯變化，此結論尚需大樣本實驗進一步驗證。

與之前所報道的成年人經肛門所排出氣體的主要的組份為氮氣（59%），氫氣（20.9%），二氧化碳（9%），甲烷（7.2%），氧 氣（3.9%）和 硫 化 氫（0.000 28%）不同，本實驗所測的早產兒腸道產氣各組成成分所占比例的遞減順序為：二氧化碳、氫氣、甲烷、硫化氫，由于技術限制，本實驗未檢測早產兒腸道產氣中氮氣、氧氣所占比例，這是本實驗有待改進之處。

本研究還存在以下不足之處：（1）納入的例數較少；（2）開展地點僅限上海市兒童醫院；（3）未能研究性別、產式、胎齡、喂養方式、生后Apgar評分、抗生素的使用等因素對早產兒腸道微生物產氣的影響；（4）未能進行足月兒與早產兒腸道微生物產氣的差異研究等。因此，本研究所得結果只是腸道微生物產氣方面的初步探索，需增大樣本量進一步研究。同時，新生兒壞死性小腸結腸炎、新生兒乳糖不耐受、敗血癥等疾病是否會影響腸道微生物產氣，如果有影響，其差異是否具有特異性，這種差異是否有助于疾病的早期診斷等，均是今后研究方向。

作者貢獻聲明王雪芳實驗構思與設計，數據采集，數據分析，繪制圖表，論文撰寫和修訂。李娟，李娜實驗構思與設計，數據采集，數據整理與保存，論文修訂。尹迪，張華婷數據統計與分析，論文修訂。朱立穎提供材料、樣品、試劑、案例。龔小慧論文修訂。胡勇可行性分析，監督指導，獲取資助，論文修訂。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。