程序性細胞壞死參與急慢性損傷腦內神經元死亡的研究進展

錢奕茗（綜述） 孫鳳艷（審校）

（復旦大學基礎醫學院神經生物學系 上海200032）

細胞的死亡和新生是機體維持穩態環境的根本。1973年，Schweichel和Merker兩位學者按照細胞死亡的形態學特點，將細胞死亡分為3大類：壞死（necrosis）、凋 亡（apoptosis）和 自 噬（autophagy）［1］。隨著研究的逐步深入，新的細胞死亡方式和特征被不斷發現。為此，2005年國際上成立了細胞死亡命名委員會（the Nomenclature Committee on Cell Death，NCCD）。NCCD專家根據細胞死亡方式不同提出細胞意外死亡（accidental cell death，ACD）和調節細胞死亡（regulated cell death，RCD）的分類法，并給出了新的定義。ACD是一類由各種傷害性刺激引起，且不受細胞內主動的程序性因素控制的細胞死亡方式，例如壞死；RCD通常為程序性細胞死亡過程，該類細胞死亡受到復雜的信號級聯反應分子的調控。凋亡和自噬就屬于RCD類型。近年來，以RCD形式的細胞死亡新類型被不斷地發現，本文將介紹一種細胞壞死新的形式，即程序性細胞壞死。

傳統認為，細胞壞死是一種被動的非程序性細胞死亡形式，常常伴有炎癥的發生；而細胞凋亡和自噬則是一種主動的程序性細胞死亡過程［2］。隨著細胞死亡相關研究的不斷深入，人們發現有一類細胞死亡的形態特征與壞死相似，但是死亡過程類似凋亡的發生，即受到細胞內在信號分子的調節，抑制信號通路的藥物能調節這類細胞死亡的發生發展［3］。由此改變了人們長期以來對壞死的定義，并命名這類受胞內信號分子調控的細胞壞死為necroptosis，即 取 壞 死necrosis字 首necro-，以 及apoptosis的字尾-ptosis而得名。本文意譯暫稱程序性細胞壞死。細胞膜上的死亡受體（Fas/TNF receptor associated factor/tumor necrosis factor receptor，Fas/TRAF2/TNFR等）激活可誘導程序性壞死［4］，通過激活受體相互作用蛋白（receptor interaction protein，RIPK1/RIPK3）激酶及關鍵底物——混合譜系激酶結構域樣蛋白（mixed lineage kinase domain-like protein，MLKL）信號傳導通路，使細胞膜完整性丟失、細胞器腫脹、線粒體功能障礙以及產生氧自由基等，導致細胞死亡［5-7］。深入研究表明，炎性細胞因子的分泌釋放能激活程序性細胞壞死。開展對于程序性細胞壞死的研究和總結，能夠幫助我們更好地理解相關疾病的病理過程，有助于疾病治療的潛在靶點的研發。

程序性細胞壞死及其調節分子程序性細胞壞死的發生有兩個重要的前提：（1）細胞能夠表達RIPK3；（2）caspase-8活性受到抑制。啟動程序性細胞壞死的受體有TNFR、Toll樣受體3/4（Toll like receptors 3/4，TLR3/4）以及干擾素受體（interferon receptors，INFR）。病毒感染和藥物等外界因素激活死亡受體可誘導其發生［8］。目前，人們對TNF-α介導的程序性細胞壞死研究最為詳細。如圖1所示，TNF-α與 受 體TNFR1相 結 合，在 胞 內 募 集RIPK1、TRAF2、細 胞凋亡抑 制蛋白（inhibitor of apoptosis proteins，cIAPs）等信號分子聚集，并在胞膜上形成復合物Ⅰ［9-10］。復合物Ⅰ依據接收的信號刺激對RIPK1進行不同修飾，從而決定細胞的存亡［11］。此時，caspase-8的作用至關重要。當caspase-8被激活時，RIPK3的活化被抑制，形成復合物Ⅱa，誘導細胞發生凋亡；然而，當caspase-8失活或缺失時，會促進RIPK1去泛素化，并與RIPK3、Fas相關死亡結構域蛋白（Fas-associating death domain-containing protein，FADD）結合，共同形成復合物Ⅱb?；罨腞IPK1和RIPK3募集和磷酸化MLKL，激活下游信號轉導通路，從而執行程序性細胞壞死［12-13］。目前認為，MLKL激酶的活化是執行程序性細胞壞死的重要環節。

MLKL是RIPK3激酶的底物，本身以無活性形式存在。MLKL的C末端區域含激酶結構域，N末端 含4螺 旋 結 構 域（four-helical bundledomain，4-HBD）。MLKL激酶的活化依賴于RIPK3誘導激酶結構域的殘基磷酸化。人類MLKL的Thr357和Ser358及 小 鼠MLKL的Ser345、Ser347和Thr349殘基是RIPK3誘導磷酸化的位點。當磷酸化的RIPK3（p-RIPK3）與MLKL的4HBD結 合，引 起MLKL磷酸化（p-MLKL），從而使MLKL從無活性的單體結構轉變為有活性的寡聚體結構。p-MLKL與p-RIPKs結合形成壞死小體，導致p-MLKL向質膜遷移，并與質膜上的磷脂酰肌醇脂結合，錨定在細胞的質膜上，破壞膜的結構和功能的完整性，促使細胞發生死亡［14］。p-MLKL錨定于細胞器線粒體膜，導致線粒體膜電位去極化和線粒體功能受損。p-MLKL錨定于細胞膜時，促進胞外Ca2+和Na+內流，增加細胞膜對水的通透性，引起細胞腫脹、崩解和 死 亡［8，15］。研 究 發 現，使 用 選 擇 性RIPK1或MLKL磷 酸化抑制劑，抑 制MLKL或RIPK3蛋 白的表達均可抑制程序性細胞壞死的進程［16］。這些研究結果說明了RIPK3及MLKL分別發揮了啟動和執行程序性細胞壞死的作用，為確定參與程序性細胞壞死的調節因子提供了直接的科學證據。

圖1 程序性細胞壞死的分子信號調節通路及抑制劑作用機制的示意圖Fig 1 Chematic diagram of molecular signaling pathways and inhibitor mechanisms in necroptosis

RIPK1/RIPK3的磷酸化蛋白質的磷酸化對激酶活性有重要影響。RIPK是一類含有高度保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶結構域的蛋白激酶［17］。RIPK1的C端含死亡結構域和RIP同源結合基序（RIP homotypic interaction motif，RHIM）結構域［18-19］。RIPK1和RIPK3的N端含有多個磷酸化位點的結構域。其中，RIPK1的Ser89和Ser161磷酸化可激活程序性細胞壞死的過程。體外激酶分析實驗表明，RIPK1的Ser166位點能夠發生自磷酸化［20］，并激活下游IL-1β的合成，這被認為是介導程序性細胞壞死的一個關鍵起始位點。

在RIPK的序列中RIHM的結構域和RIPK3磷酸化的活性區是激活程序性細胞壞死信號通路的必要條件。RIPK3的Ser232是重要的磷酸化位點［8］。模擬磷酸化研究顯示，RIPK3的Ser232磷酸化激活RIPK3激酶的活性，通過RIPK3的Ser227募集和結合MLKL［21］，從而執行細胞壞死的指令。RIPK3過表達也能促進程序性細胞壞死的發生［22］，這提示RIPK3在程序性細胞壞死發生中的重要性。

研究程序性細胞壞死的常用方法在人們了解蛋白質磷酸化是程序性細胞壞死啟動的關鍵環節以前，對程序性細胞壞死的判斷通常采用細胞形態學結合藥物抑制劑的間接方法來判斷。例如，根據形態學，人們將幾種細胞死亡方式（凋亡、壞死、自噬）相比較，發現了程序性細胞壞死特有的形態表現，包括胞膜破裂、細胞內容物直接釋放、DNA的逸出和雙鏈斷裂等，藥物抑制劑可以抑制這種壞死細胞數。由此，研究者間接判斷為該壞死細胞存在程序性細胞壞死的現象。隨著研究的深入，人們對程序性壞死機制有了更深刻的了解，先后發展和制備了特異性抗體和不同環節的工具藥。目前，科學家已經建立了形態學、功能學和生化分析等多種手段供相關研究。

形態學分析方法已知，原位末端轉移酶標記法（TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL）可以標記雙鏈DNA斷裂，TUNEL陽性標記的細胞可以反映存在凋亡或壞死。在這個基礎上，人們使用藥物拮抗劑抑制RIPK蛋白表達和磷酸化，再結合TUNEL標記技術，在顯微鏡下觀察TUNEL標記細胞數量有無變化。若使用RIPK抑制劑可以減少TUNEL標記細胞數，就可以明確該TUNEL標記細胞與程序性細胞壞死有關。Degterev等［3］采用該技術研究報道了RIPK1抑制劑Nacrostatin-1（Nec-1）能夠拮抗程序性細胞壞死進程，從而在腦缺血損傷的病理過程中產生保護作用，還明確了RIPK1介導程序性細胞壞死的過程。

隨著對激酶RIPK1/RIPK3結構以及活性機制的深入了解，人們發現該類蛋白磷酸化是程序性細胞壞死發生的核心環節。采用選擇性磷酸化的RIPK1/3及磷酸化的MLKL抗體結合免疫熒光多標記組織化學染色技術，我們能夠在共聚焦熒光顯微鏡下直觀而清晰地觀察到細胞的存亡與細胞內特定磷酸化蛋白的定位關系。這些技術的發明為了解組織中存在程序性細胞壞死提供了直接的分析手段。

免疫印跡法蛋白質印跡法（Western blot，WB）也被用于開展程序性細胞壞死機制的研究。根據磷酸化和非磷酸化蛋白的相對分子質量不同，電泳將磷酸化和非磷酸化蛋白分離，結合采用特異性磷酸化的RIPK1/3及MLKL抑制劑，通過分析組織樣品中不同相對分子質量的RIPK1/3及MLKL差異條帶的變化，推測該通路的被激活的狀態。研究者們也可以選用針對不同的磷酸化位點的RIPK1/3及MLKL抗體進行WB分析。RIPK1/3及MLKL磷酸化位點的發現為研發各類分子的拮抗劑、小分子干擾劑和抗體提供了重要理論基礎。

藥物抑制劑的分析RIPK1/3和MLKL的磷酸化是激活程序性細胞壞死的信號通路的必要條件。據此，已研發了多種針對程序性壞死信號通路不同環節的抑制劑。其中，RIPK-1抑制劑Nec-1［3］和MLKL抑制劑NSA［23］是研究較為深入的兩種。另外，Nec-7也能抑制程序性細胞壞死［24］，但其作用機制尚不明確。NSA在細胞實驗中表現出對MLKL有較強抑制作用。在整體應用時，NSA的代謝極快，從而限制了全身應用的有效性。研究發現，一種靶向治療晚期黑色素瘤的藥物Tafinlar具有抑制MLKL的Ser358磷酸化、阻止MLKL被募集的作用［25］。另有研究報道，miRNA-155［26］亦可通過靶向阻斷RIPK1合成，抑制細胞壞死的發生。GSK系列的小分子具有抑制RIPK3激酶活性的作用，Pazopanib是一種新穎的酪氨酸激酶抑制劑，能抑制RIPK1/3磷酸化，從而抑制酶活性。實驗研究證明，RIPK3激酶抑制劑具有靶向抗腫瘤血管生成作用，其是否具有臨床治療效果依然需要進一步研究［27］。各藥物抑制劑及其作用機制詳見表1。

表1 程序性細胞壞死的藥物抑制劑及其作用機制Tab 1 Drug inhibitors of necroptosis and their mechanism of action

回顧開展程序性細胞壞死研究的技術發展歷程，從早期的藥物分析法到采用特異性抗體進行形態學和生化的蛋白磷酸化分析法，反映了從間接推測到直接提供依據的研究發展的過程。這些技術的發展，對深入研究程序性細胞壞死的病理生理學意義提供了重要的分析工具。

程序性細胞壞死與腦內非感染性炎癥程序性細胞壞死發生時，由于細胞膜的破壞，細胞內容物從胞質中釋放，這些內源性分子屬于損傷關聯分子 模 式（damage associated molecular patterns，DAMPs），免疫細胞能夠通過模式識別受體攝取這些分子，從而引起劇烈的炎癥反應。2012年，有研究發現炎癥小體NOD樣受體蛋白3（Nod-like receptor pyrin domain-containing protein 3，NLRP3）或caspase-8能在RIPK3的作用下激活炎癥小體的形成［34］。當然，RIPK1和MLKL同樣也參與到了炎癥反應中，其各自的作用機制仍有待進一步闡明。

經典的NLRP3炎癥小體活化由兩種信號共同激活：第一信號激活TLR4信號通路，促進細胞核因子-κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）激活白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和IL-18等前體產生；第二信號則促進NLRP3/ASC/pro-caspase-1蛋白復合物炎癥小體的形成，其中pro-caspase-1活化形成caspase-1，后者將IL-1β和IL-18前體剪切活化并釋放到胞外［35］。非經典的活化則不依賴TLR4信號通路，由caspase-4/5/11介導發生，在拮抗和清除病原微生物感染中發揮重要作用［34］。

整體腦缺血實驗和離體培養細胞的實驗研究均證明NLRP3炎癥小體參與缺血缺氧誘導的神經元死亡過程，NLRP3和ASC表達增加，以及caspase-1活化，下游炎癥因子IL-1β、IL-6均參與了OGD誘導的小鼠原代皮層神經元的壞死過程［36］。另外，腦缺血后壞死的神經元釋放大量TNF-α和IL-1β，引發鄰近小膠質細胞向M1方向極化［37］，加劇促炎因子和毒性物質釋放，導致神經細胞死亡。因此被認為炎癥反應同樣是缺血性腦損傷預后不良的因素。

程序性細胞壞死與缺血性腦損傷近年來研究報道了RIPKs-MLKL信號通路激活參與缺血性損傷腦內神經元的細胞程序性壞死作用。采用免疫熒光染色和蛋白質磷酸化分析發現，缺血損傷腦內表達p-RIPK1和p-MLKL蛋白含量增加，采用RIPK1抑制劑Nec-1能夠阻止缺血損傷引起的腦內p-RIPK1以及p-MLKL蛋白表達，減少p-RIPKTUNEL雙標記的程序性壞死細胞數，縮小梗死面積，促進神經功能的恢復［28］。另外，離體實驗發現小分子化合物GSK-872是一種高效和特異的RIPK3抑制劑。在離體的氧糖剝奪（oxygen glucose deprivation，OGD）模型和整體腦缺血模型上均證明，GSK-872具有抑制低氧誘導RIPK1/3和MLKL蛋白磷酸化的作用，同時減少神經元的死亡和減輕腦損傷的程度，從而發揮神經保護作用［29］。進一步的機制分析發現，用GSK-872或siRNA抑制RIPK3的表達，可以抑制由OGD誘導的RIPK1/3和MLKL蛋白磷酸化以及缺血缺氧誘導的腦內低氧誘 導因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）的表達。但是，采用siRNA抑制HIF-1α的表達可產生神經保護效應，卻不影響RIPK1/3和MLKL蛋白及其磷酸化蛋白的表達量。由此提示缺血缺氧激活腦內程序性壞死信號分子RIPK1/3和MLKL磷酸化，后者可能是通過誘導HIF-1α表達產生細胞死亡。

程序性細胞壞死與神經退行性疾病程序性細胞壞死最先被發現于腦缺血損傷的病理表現中。越來越多的研究報道，程序性細胞壞死參與到多種神經退行性疾病的病理進程中，包括帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）［38］、肌 萎 縮 側 束 硬 化（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）［39-40］、多 發 性 硬化（multiple scalerosis，MS）［41］和 阿 爾 茨 海 默 ?。ˋlzheimer’s disease，AD）［42］。這類疾病的病理特征均表現為神經細胞進行性丟失和死亡的過程。目前，我們對這類疾病的病理機制了解還不甚清楚，但是近年的研究證明，程序性神經細胞壞死參與這些神經退行性疾病的發生和發展過程（表2）。

表2 程序性細胞壞死與神經疾病的關系Tab 2 Relationships between necroptosis and neurological diseases

MS是一種常見的中樞神經系統退行性疾病，其病理特征為神經元軸突的少突膠質細胞的丟失和脫髓鞘。在動物實驗模型研究中已發現，在MS發生發展過程中，TNF-α作為促炎細胞因子，在caspase-8缺乏的情況下，激活RIPK1和RIPK3介導的程序性細胞壞死通路，引起神經元的退行性病變，誘導少突膠質細胞的變性死亡。抑制RIPK1可防止TNF-α誘導的少突膠質細胞死亡，表明程序性壞死參與MS病理的發生發展過程，靶向RIPK1抑制劑可能是MS的一種治療策略。

ALS是以脊髓運動神經元丟失，導致軸突潰變為主的病變，患者表現為進行性運動功能退變，晚期患者表現為偏癱和呼吸困難，乃至窒息。因此，該病俗稱“漸凍癥”。ALS的病理機制并不清楚，有報道ALS分為家族性和散發性。目前認為SOD缺失導致氧化損傷是誘導ALS發生的主要原因之一。因此，SOD1G93A轉基因小鼠往往用于ALS疾病模型研究。另外，還有些基因突變參與疾病發生，如視神經蛋白（optineurin，OPTN）缺失。Ito等［39］研究表明，在SOD1G93A轉基因小鼠和人類ALS患者的病理樣本中，通?？蓹z測到RIPK1和RIPK3。另外，OPTN缺失轉基因小鼠表現為脊髓運動神經元死亡和軸突潰變。該作用通過Nec-1抑制RIPK1活性而減弱。敲除RIPK3的表達也可以阻止OPTN缺失小鼠引起的脊髓運動神經元丟失和軸突潰變。由此提示，在ALS的病理發展過程中，脊髓神經組織內的RIPK1、RIPK3和MLKL信號通路激活并參與進行性運動神經元死亡和神經軸突的退化。此外，抑制RIPK1或RIPK3激酶能否成為這類疾病的臨床治療藥物還有待深入研究。

PD是一種以腦內黑質多巴胺神經元丟失為病理特征的，精神行為異常和運動功能減弱為臨床表現的神經退行性疾病。引起多巴胺神經元死亡的機制十分復雜，包括神經元自身代謝性氧化損傷、疾病基因和炎癥反應等。近年來的研究提示程序性細胞壞死參與多巴胺神經元死亡的病理過程。PD研究的常用細胞模型由藥物或基因突變誘導制備。其中，6-羥基多巴胺（6-hydroxydopamine，6-OHDA）是常用的工具藥。研究者利用6-OHDA誘導培養細胞死亡模型發現，6-OHDA引起線粒體功能障礙，導致自噬增加，組織蛋白酶B（cathepsin B）表達增加，Bcl-2表達減少，引起細胞死亡。而RIPK1的抑制劑Nec-1能預防6-OHDA的細胞毒性，穩定線粒體的膜電位，抑制過度的自噬，同時降低微管相關蛋白輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）和組織蛋白酶B的表達，增加了Bcl-2的表達，減少細胞的死亡［38］，由此提示了RIPK1磷酸化激活參與帕金森的病理性細胞死亡過程。

AD是以腦內膽堿能神經元丟失、老年斑和神經纖維纏結形成為病理特征，臨床主要表現為精神活動異常和認知功能減退為主的神經退行性疾病。主流觀點認為引起AD病理變化的機制為腦內Aβ的聚集形成老年斑，Tau蛋白異常磷酸化引發神經纖維纏結。老年斑和神經纖維纏結形成是進一步觸發腦內神經元病理發展的元兇。因此，科學家建立了多種與病理機制有關的模式動物模型開展研究，包括APP/PS1和5xFAD小鼠。最近，神經炎癥和腦內的免疫反應參與AD病理過程受到廣泛重視和認可。小膠質細胞被認為是腦內的免疫細胞，它介導腦內炎癥和免疫反應。腦內Aβ沉積可誘導小膠質細胞向M1方向極化，促進炎癥小體的形成［43］。已知炎癥小體具有激活RIPK1/3的作用，從而誘導程序性細胞壞死的發生。為了證明炎癥介導的程序性細胞壞死參與AD腦內神經元退行性病理過程，Caccamo等［42］首先觀察AD患者腦內表達程序性細胞壞死標志蛋白RIPK 1和MLKL；其次，采用兩種常用的AD模式動物（APP/PS1和5xFAD小鼠）進行整體動物和離體神經元培養模型開展研究。結果發現，在AD患者腦內表達程序性壞死標記蛋白RIPK1和MLKL的量增加，這種增加與腦內神經元的存活以及認知功能呈負相關；在5xFAD小鼠腦內觀察到RIPK1和MLKL表達增高的類似結果。同時，APP/PS1小鼠腦內高表達MLKL蛋白導致海馬神經元丟失，伴有學習能力和記憶功能減退癥狀。反過來，采用Nec-1s抑制RIPK/MLKL信號通路活性，具有增加APP/PS1小鼠皮層的培養神經元存活的作用。若Nec-1s全身應用3周后，5xFAD小鼠腦內p-MLKL表達下降，Fluoro-Jade著色的退行性病變神經元數量明顯減少。以上結果明確提示減少腦內RIPK/MLKL信號通路活性具有減少AD轉基因動物腦內神經元死亡和改善認知功能的作用［42］。這些證據有力地說明程序性細胞壞死參與了AD腦內神經元丟失的病理過程。這些結果不僅拓寬了人們對AD病理機制的理解和治療研究的思路，還提示通過藥物有效減少程序新細胞壞死可能有助于延緩疾病的癥狀發生和發展。

結語程序性細胞壞死是免疫炎癥相關的一種細胞死亡形式，其分子機制對胚胎發育和新生兒成長有重要影響。同時，程序性細胞壞死也參與到組織穩態調節和各種病理過程的發展中。免疫炎癥反應涵蓋了諸多復雜的機制，是由免疫系統中各種因素共同制衡而產生的。程序性細胞壞死在不同時期、不同部位影響著免疫系統，探索其如何調控免疫細胞的分子表型能夠幫助我們加深理解，并有助于區分各類細胞死亡的形式及其病理生理學意義。此外，RIPK1/RIPK3的靶向研究對開展神經退行性疾病的病理機制和防治策略方面的研究有重要意義，未來研究的焦點在于深入相關分子作用機制，并致力于研發調控程序性細胞壞死的藥物。

作者貢獻聲明錢奕茗論文構思、撰寫和修訂，繪制圖表。孫鳳艷論文審校和修訂。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。