Hippo信號通路與腎臟損傷修復的研究進展

周蔚然（綜述） 趙 栓 丁小強（審校）

（復旦大學附屬中山醫院腎內科 上海200032）

Hippo信號通路在各物種之間高度保守，通過調控細胞增殖-凋亡平衡在維持組織穩態和器官形態方面具有重要作用［1-5］。目前已經證實Hippo信號通路參與心臟、肝臟及腸道等多種器官損傷后的再生修復過程［6-8］。近年來，Hippo信號通路在腎臟疾病中的作用得到越來越多的關注。深入理解Hippo通路在腎臟損傷后發揮的作用及其機制，將有助于找到Hippo通路的相關靶點，為急慢性腎臟病的治療提供有效的治療策略。

Hippo信號通路的組成和生物學功能

Hippo信號通路的組成在哺乳動物中，Hippo信號通路是哺乳動物不育系20樣激酶1/2（mammalian sterile 20-likekinase 1/2，MST1/2）、大腫瘤抑制激酶1/2（large tumor suppressor 1/2，LATS1/2）、Yes激 酶 相 關 蛋 白（Yes-associated protein，YAP）/含PDZ結合基序的轉錄共激活因子（transcriptional co-activator with PDZ-binding motif，TAZ）組成的三步激酶級聯信號通路。Hippo信號通路的激活過程為：MST1/2與調節蛋白SAV1（salvador homolog 1）結合，磷酸化激活LATS1/2，LATS1/2與 調 節 蛋 白MOB1（Mps one binder kinase activator-like 1）結合進一步磷酸化下游分子YAP/TAZ，磷酸化的YAP并無活性，滯留在細胞質中，隨后通過泛素蛋白酶體途徑降解。而當Hippo信號通路受到抑制，YAP去磷酸化激活，入核與TEA轉錄因子（TEA domain transcription factor，TEAD）結合，啟動下游靶基因的表達［9］（圖1）。

圖1 Hippo信號通路示意圖Fig 1 Principle of Hippo pathway

Hippo信號通路的生物學功能YAP和TAZ

是Hippo信號通路中的兩個共激活轉錄因子，入核后通過結合序列特異性轉錄因子TEAD 1～4來調節 下 游 基 因 表 達［10］。TEAD結 合YAP的S94A位點并且顯著增強YAP的轉錄活性，該位點的突變則抑制Hippo通路下游基因的表達［11］。TAZ是YAP的旁系同源物，和YAP具有約50%的序列同源性和相似的結構［12-14］，但是兩者的功能并不完全相同，敲除YAP導致胚胎早期死亡或者卵黃囊血管生成缺陷，而敲除TAZ后導致小鼠罹患囊性腎臟疾病［15-16］。

Hippo信號通路受到多種因素的調控。與表皮生長因子受體（epithelial growth factor receptor，EGFR）信號通路、轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）信號通路或Wnt通路等其他經典信號通路不同，Hippo信號通路沒有特定的受體和細胞外配體。機械應力、氧化應激、細胞密度或者細胞間連接的變化都能調控Hippo信號通路［1，17-19］。細胞受到的機械應力是Hippo通路重要的調節因素，當細胞在堅硬表面上生長或暴露于較大的機械應力環境時會抑制Hippo通路，激活YAP/TAZ［20-21］。此外，在細胞密度較高時，細胞之間產生接觸抑制，激活Hippo通路；而當細胞密度較低時，Hippo通路被抑制，YAP入核并促進靶基因轉錄和細胞增殖［22］。此外，Hippo通路還受其他信號通路調節。例如，G蛋白偶聯受體（G protein-coupled receptor，GPCR）途徑可以通過F-actin調節YAP/TAZ活性［23］；Wnt/β-catenin通路與YAP/TAZ有直接的相互作用［24］；Src家族激酶可以激活YAP［25］；我們最新研究發現Rac-GTP酶激活蛋白1（Rac-GTPase activating protein 1，RacGAP1）也可以通過激活YAP促進腎小管上皮細胞損傷后的修復［26］。總之，Hippo通路的激活/失活是一個動態過程，受胞內外多種信號通路的調節，這些通路也為調節Hippo通路活性提供了潛在的藥物靶點。

Hippo信號通路在AKI早期的作用AKI是常見的臨床危重癥，目前除了液體復蘇和腎臟替代治療等支持性療法外，尚缺乏有效的治療手段［27］。腎小管上皮細胞（tubular epithelial cell，TEC）作為腎臟中含量最高的細胞對缺血缺氧造成的損傷極其敏感，并且TEC的修復與否在AKI向慢性腎臟病（chronic kidney disease，CKD）演化過程中起到決定作用［28］。腎臟受到輕度損傷時，幸存的TEC通過去分化增殖再分化完成腎小管的修復［29］。而當腎臟受到反復損傷、嚴重損傷或者持續損傷，TECs修復不良導致腎臟間質纖維化（tubulointerstitial fibrosis，TIF）的發生［29］。Hippo信號通路在AKI后腎臟的修復和再生中扮演重要角色（表1）。

表1 Hippo通路在腎臟損傷修復中的作用Tab 1 Function of Hippo pathway in kidney injury repair

在AKI早期腎小管通過抑制Hippo信號通路促進幸存上皮細胞再生。2016年，Xu等［30］利用小鼠缺血再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury，IRI）模型進行腎臟轉錄組測序發現，在再灌注后24 h，YAP在腎臟中的表達增加了1.7倍，而LATS2表達顯著下 降。Chen等［31］在IRI-AKI小 鼠 的腎 近 端 小管 中發現YAP的蛋白水平在IRI后24 h升高，并一直持續到IRI后第7天。此外，在AKI患者腎臟中也觀察到YAP被顯著激活。使用YAP抑制劑或在小鼠腎臟中敲除YAP，在IRI后24 h至第7天小鼠腎功能相比對照組顯著惡化。Chen等［31］同時指出，小鼠腎臟中敲除TAZ對IRI小鼠腎功能恢復沒有影響，說明YAP和TAZ在AKI后可能發揮著不同的功能。Wu等［32］的最新研究提出，IRI后24 h小鼠腎臟中TAZ表達顯著上調且發揮保護作用。小鼠雙側腎盂內注射TAZ siRNA導致IRI-AKI小鼠腎小管損傷加重、小鼠腎功能惡化，而小鼠腹腔注射氯喹可以誘導小鼠腎小管中TAZ高表達，減輕小鼠IRIAKI后腎臟損傷。值得注意的是，Chen等［31］的研究采用了夾閉雙側腎蒂35 min的小鼠IRI模型，而Wu等［32］的 研 究 采 用 了 夾 閉 雙 側 腎 蒂10 min（TAZ siRNA組）和20 min（氯喹組）的小鼠IRI模型，TAZ是否在不同損傷程度的IRI-AKI后發揮不同的功能還有待進一步研究。此外，Hippo通路中的關鍵激酶MST1阻礙腎臟損傷修復過程，敲除MST1后則顯著減輕小鼠IRI后4 h的腎臟損傷［33］。

抑制Hippo信號通路主要通過促進細胞增殖同時減少細胞凋亡從而促進腎臟修復過程。細胞周期調節蛋白D（Cyclin D）被認為是YAP的靶基因之一［34-36］，小鼠IRI-AKI后6～48 h，YAP上調Cyclin D的表達水平，同時誘導視網膜母細胞瘤蛋白（retinoblastoma，Rb）磷酸化，激活周期蛋白依賴性激酶（cyclin-dependent kinases，CDK）4和CDK 6，加速細胞周期進程和幸存TECs增殖，促進腎臟適應性修復［31］。在體外培養的TEC中過表達YAP，能增加細胞缺氧復氧損傷后增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）和Ki67的表達以及G2/M和S期的細胞數量［31，37］。在乙酸鈾酰誘導的AKI大鼠模型中，YAP的激活水平與生存素的表達以及TECs的細胞抵抗能力正相關［38］。在小鼠腎臟中敲低TAZ，IRI后24 h時p38和c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）信號明顯激活，細胞周期阻滯和細胞凋亡更為嚴重［32］。敲除小鼠腎臟中的MST1基因也能抑制IRI后TECs的凋亡，起到保護作用［33］。

AKI中后期Hippo信號通路持續失活可能誘導AKI-CKD轉 化2016年，Xu等［37］最 早提 出 在IRIAKI早期激活YAP可以促進受損腎小管上皮的修復，而YAP的持續激活可能導致腎間質纖維化和腎小管異常的去分化。在該研究中，盡管YAP和pYAP的比值在大鼠輕度IRI（夾閉腎動脈30 min）和重度IRI（夾閉腎動脈45 min）后均有明顯上調，但重度IRI后YAP的活化持續了4周，而輕度IRI后YAP的活化僅有2周［37］。在重度IRI后對小鼠腹腔注射YAP激動劑（地高辛），4周后地高辛組相比對照組小鼠腎小管損傷程度和TIF程度明顯加重［37］。因此，YAP激活持續的時間與AKI嚴重程度密切相關，并且可能是AKI-CKD轉化中的關鍵因子。當損傷較輕時，YAP的短時活化有助于腎小管的修復和再生，而當損傷較重時，YAP被持續激活，導致腎臟修復不良和向CKD發展。另一研究團隊也提出，在小鼠重度IRI（夾閉左腎動脈45 min后切除右腎）后21天內YAP的表達持續增加［39］。在小鼠IRI-AKI后第7天對小鼠腎內注射YAP-shRNA后可以顯著減輕IRI-AKI導致的腎功能不全，降低TGF-β和結締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）的表達，延緩了TIF進展。因此，盡管YAP在AKI早期可能發揮保護作用，但在AKI的中后期YAP的持續激活則預示AKI的不良預后［39］。

以上研究均提示，AKI發生后短期抑制Hippo信號通路可能促進腎臟恢復，而長期抑制則可能導致AKI向CKD發展，YAP激活的程度和持續時間可能在AKI的轉歸中起到關鍵作用。

Hippo信號通路持續失活促進腎臟纖維化進展的機制

誘導小管上皮細胞的間質轉化和肌成纖維細胞形成腎臟重度損傷后，TECs發生上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）獲得間充質表型，同時分泌大量細胞外基質（extracellular matrix，ECM），促進TIF進展［40］。馬兜鈴酸（aristolochic acid，AA）可以導致AKI并誘導AKI的慢性化轉歸。AA-AKI的小鼠腎臟中TAZ和CTGF表達顯著增加。在體外培養的人腎小管上皮細胞（HK-2）中過表達TAZ，造成細胞去分化和成纖維細胞樣表型［41］。腎臟中特異性敲除SAV1的小鼠發生AAAKI后Hippo通路被抑制，腎臟中各類膠原、纖維連接蛋白和間質標志物波形蛋白的表達水平均較野生型小鼠顯著升高［42］。

肌成纖維細胞比普通成纖維細胞具有更強的合成和分泌ECM的能力，導致腎臟瘢痕化和攣縮［43-44］。肌 成 纖 維 細 胞 可 由TECs通 過EMT轉 分化形成，而腎臟固有成纖維細胞的轉化是肌成纖維細 胞 的最主要 來源［44-45］。在 單 側輸尿管 梗阻（unilateral ureter obstructive，UUO）小鼠模型中，抑制YAP/TAZ可以阻斷TGF-β誘導的成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化，從而抑制ECM產生、延緩TIF進展［46-47］。此外，YAP是細胞對生物力學信號的感受器，可以被ECM激活，促進成纖維細胞轉化為肌成纖維細胞。ECM的積累與YAP的激活形成正向反饋調節，導致腎臟纖維化的持續進展［47］。綜上，AKI中后期YAP/TAZ的持續激活不僅調控EMT進程，也誘導成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化，從而促進TIF的進展。

調控巨噬細胞M2型極化和炎癥反應調控巨噬細胞（macrophage，M?）在不同的刺激下可以極化為經典活化的M1型M?或者替代活化的M2型M?。M2的持續活化會通過促進ECM生成、分泌基質金屬蛋白酶以及巨噬細胞-肌成纖維細胞轉化等途徑導致腎小管間質損傷和腎臟纖維化［48］。在UUO和IRI兩種腎臟損傷模型中，敲除TAZ或者抑制YAP可以阻斷Wnt5a和TGF-β1誘導的M?向M2型極化，從而延緩腎臟纖維化的進展［49］。另一研究中，敲除MST1/2后小鼠腎臟皮質和髓質中巨噬細胞數量明顯增加，而同時敲除MST1/2和YAP后，小鼠腎臟的炎癥和纖維化水平與對照組無異，進一步說明YAP在巨噬細胞活化中的核心作用［50］。持續性的炎癥反應也是導致腎臟纖維化的重要原因，在小鼠腎臟中，TNF-α和YAP之間可以形成正反饋促進腎臟炎癥反應和纖維化的進展［50］。

介導TEC細胞周期阻滯和細胞肥大G2/M期檢查點是細胞周期的重要調控靶點，參與腎臟損傷修復及纖維化過程［51］。發生G2/M期阻滯的TECs大量表達纖維化因子，導致小管上皮過度修復并發生纖維化［52］。TAZ在UUO小鼠腎臟中被大量激活，導致腎小管上皮細胞G2/M期阻滯和生長受抑，提示TAZ的過度激活是腎小管不良修復的重要原因［41］。

腎臟代償性肥大（renal compensatory hypertrophy，RCH）是指腎臟損傷后由于腎單位數量的減少導致的殘余腎單位的代償性生長，是CKD的病理改變之一。目前認為，適度的RCH可以在一定程度上代償正常的腎臟功能，而過度的RCH會導致小管肥大，間質纖維化和腎功能的進行性下降［53］。RCH動物模型中YAP被大量激活，通過活化Akt/mTOR信號通路導致腎臟細胞肥大［54］。

結語在AKI早期，Hippo信號通路的失活對腎臟適應性修復具有促進作用，而Hippo信號通路的持續失活可能導致AKI向CKD的進展（圖2）。目前，我們對YAP/TAZ在腎臟疾病中的激活和作用機制認識尚淺，腎臟損傷后YAP/TAZ激活的觸發因素、Hippo信號通路與其他信號通路的相互作用以及調控機制還有待深入研究。因此深入闡明Hippo信號通路在AKI中的作用機制，將為腎臟損傷后的修復和再生提供新的思路。

圖2 Hippo信號通路在急性腎損傷后發揮不同作用Fig 2 The function of Hippo pathway after acute kidney injury

作者貢獻聲明周蔚然論文構思和撰寫，文獻調研，繪制圖表。趙栓論文設計和修訂，獲取資助。丁小強論文設計和修訂，監督指導。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。