抗生素對刺芹側耳菌絲生長的影響

姜 寧 李正鵬 周 峰 董浩然 李巧珍 李 玉

(上海市農業科學院食用菌研究所，農業農村部南方食用菌資源利用重點實驗室，國家食用菌工程技術研究中心，國家食用菌加工技術研發分中心，農業農村部應用真菌資源與利用重點開放實驗室，上海市農業遺傳育種重點開放實驗室，上海 201403)

刺芹側耳（Pleurotnseryngii）俗稱杏鮑菇，隸屬于真菌界、擔子菌門、傘菌綱、蘑菇目、側耳科、側耳屬[1]，是目前國內進行規模化生產的主要食用菌之一。同時，刺芹側耳菌肉肥厚，質地脆嫩，菌柄脆滑，味道鮮美，有淡淡的杏仁香味和肥嫩的鮑魚口感，因而被稱為“平菇王”“干貝菇”“草原的美味牛肝菌”[2]。此外，刺芹側耳營養豐富，富含多種氨基酸、多糖和寡糖，具有防癌抗癌、降血脂、降膽固醇以及提高人體免疫力等功效。

近年來，食用菌的遺傳轉化及功能研究成為了熱點，常用的遺傳轉化方法有PEG介導轉化法[3]、限制性內切酶介導的DNA轉化法[4]、基因槍轉化法[5]、電激轉化法[6]、根癌農桿菌介導的遺傳轉化法等。其中，根癌農桿菌介導的遺傳轉化法是一種天然的轉化載體系統，具有操作方便、不需要復雜的儀器設備、轉化成本低且轉化效率高、容易獲得單拷貝的轉化菌株、重復性較高、在食用菌轉化的受體選擇上具有靈活性等優點[7-8]，故近年來該遺傳轉化法在雙孢蘑菇[9]、糙皮側耳[10]、香菇[11]、金針菇[12]、刺芹側耳[13]等食用菌中已取得了一定的研究成果。但在根癌農桿菌介導的刺芹側耳的遺傳轉化研究中，轉化受體對于卡那霉素、氨芐青霉素、頭孢噻肟鈉、潮霉素等抗生素的敏感性是運用該技術的關鍵，而且選擇合適的篩選標記基因以及抗生素濃度對提高轉化效率都具有很大的影響。在此背景下，筆者擬在根癌農桿菌介導的刺芹側耳的遺傳轉化研究中，對常用抗生素對刺芹側耳菌絲生長的影響進行研究和探索，以期為進一步建立并優化根癌農桿菌介導的刺芹側耳的遺傳轉化體系提供理論基礎。現將相關試驗結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 供試菌株和試劑

供試菌株為刺芹側耳“國森一號”菌絲體，保藏于上海市農業科學院食用菌研究所。供試抗生素為卡那霉素、氨芐青霉素、頭孢噻肟鈉、潮霉素，均購于生工生物工程(上海)股份有限公司。供試馬鈴薯葡萄糖瓊脂購于碧迪醫療器械（上海）有限公司。

1.2 培養基配制

將馬鈴薯葡萄糖瓊脂稱取39 g溶于1 L蒸餾水中，徹底混勻，用玻璃棒快速攪拌加熱3 min，待粉末完全溶解后，用500 mL三角瓶分裝，在121 ℃的高溫高壓下滅菌20 min，冷卻至40～45 ℃，加入不同濃度的抗生素，充分混勻后倒入培養皿中，待培養基凝固后進行接種。

培養皿中抗生素的終濃度分別為：卡那霉素0、25、50、75、100、125 mg/L，氨芐青霉素 0、25、50、75、100、125 mg/L，頭孢噻肟鈉0、100、200、300、400、500 mg/L，潮霉素0、10、20、30、40、50 mg/L。

1.3 菌種活化培養與接種

將液氮中保藏的刺芹側耳“國森1號”菌種轉接到PDA培養皿中進行活化培養，待菌絲長滿平板時用打孔器打孔，將打孔菌塊分別接種到含有4種抗生素不同濃度的培養皿中，并用封口膜封口，然后將其置于25 ℃培養房中進行恒溫培養。每種抗生素、每個濃度梯度接種3組作為平行對照。

1.4 測定項目

觀察記錄不同種類、不同濃度下抗生素培養皿中的刺芹側耳菌落形態、菌絲生長速率、抗生素對菌絲生長的抑制率。即在刺芹側耳菌絲培養10 d時，觀察記錄培養皿中刺芹側耳菌絲的生長狀態，測量計算每個培養皿中刺芹側耳菌絲生長速率和抗生素對菌絲生長的抑制率。計算公式為：菌絲生長速率（mm/d）=菌絲生長長度÷菌絲培養天數；抗生素對菌絲生長的抑制率（%）=(對照菌絲生長速率-抗生素處理菌絲生長速率) ÷對照菌絲生長速率。

2 結果與分析

2.1 卡那霉素對刺芹側耳菌絲生長的影響

經試驗期間觀察，刺芹側耳菌絲在含有卡那霉素抗生素的培養皿中生長正常，菌絲潔白均勻，長勢旺盛，與對照培養皿中的菌絲生長狀況無明顯差異。由表1可知，刺芹側耳菌絲生長速度隨著卡那霉素濃度的升高而降低；卡那霉素對刺芹側耳菌絲生長具有輕微的抑制作用，但僅在濃度為125 mg/L時，卡那霉素對菌絲生長的抑制率高于10%。因此，卡那霉素不適合作為刺芹側耳遺傳轉化的篩選抗生素進行使用。

表1 卡那霉素對刺芹側耳菌絲生長的影響

2.2 氨芐青霉素對刺芹側耳菌絲生長的影響

經試驗期間觀察，刺芹側耳菌絲在含有氨芐青霉素抗生素培養皿中生長正常，菌絲厚實健壯，潔白濃密，平滑均勻，與對照培養皿中的菌絲生長狀況無明顯差異。由表2可知，低濃度的氨芐青霉素可以促進刺芹側耳菌絲生長，雖然隨著氨芐青霉素濃度的升高，對刺芹側耳菌絲生長的抑制率也隨之增加（濃度為50 ml/L除外），但是氨芐青霉素并不會抑制刺芹側耳菌絲生長。因此，氨芐青霉素不適合作為刺芹側耳遺傳轉化的篩選抗生素進行使用，但可用作根癌農桿菌侵染刺芹側耳菌絲受體后抑制根癌農桿菌生長的抗生素，其在抑制根癌農桿菌生長的同時不會影響刺芹側耳菌絲的生長。

表2 氨芐青霉素對刺芹側耳菌絲生長的影響

2.3 頭孢噻肟鈉對刺芹側耳菌絲生長的影響

由表3可知，頭孢噻肟鈉對刺芹側耳菌絲生長沒有明顯的抑制效果，且經試驗期間觀察，在含有不同濃度頭孢噻肟鈉抗生素的培養皿中，刺芹側耳菌絲都能正常生長，菌落形態規則、齊整，與對照培養皿中的菌絲生長狀況無明顯差異。因此，頭孢噻肟鈉可用作根癌農桿菌侵染刺芹側耳菌絲受體后抑制根癌農桿菌生長的抗生素，其在抑制根癌農桿菌生長的同時不會影響刺芹側耳菌絲的生長。

表3 頭孢噻肟鈉對刺芹側耳菌絲生長的影響

2.4 潮霉素對刺芹側耳菌絲生長的影響

由表4可知，濃度為10 mg/L的潮霉素已經對刺芹側耳菌絲生長有明顯的抑制效果，當濃度達到40 mg/L時，潮霉素對刺芹側耳菌絲生長的抑制率達96.95%，當濃度達到50 mg/L時，刺芹側耳菌絲無法生長，被完全抑制。同時，經試驗期間觀察，在含有不同濃度潮霉素的抗生素培養皿中，刺芹側耳的接種菌塊顏色變深、發黑，菌絲發黃發黑、稀疏細弱，無法正常生長。因此，潮霉素可用作刺芹側耳遺傳轉化的篩選抗生素。

表4 潮霉素對刺芹側耳菌絲生長的影響

3 小結與討論

篩選標記基因是一種已知序列或已知功能的基因，在遺傳轉化中擔負著區分轉化子和非轉化子的重要作用。在篩選壓力下，不含標記基因及其產物的非轉化子死亡，而轉化子由于具有抗性，可以繼續存活，因而有利于區分轉化子和非轉化子[14]。因此，合適的篩選標記基因及其相應的篩選劑是生物體遺傳轉化成功的關鍵。

卡那霉素是遺傳轉化研究中被廣泛應用的抗生素篩選劑。本研究發現，在卡那霉素不同試驗濃度下，刺芹側耳菌絲生長正常，表明卡那霉素對刺芹側耳菌絲生長沒有顯著的抑制效果，不能達到區分轉化子和非轉化子的目的。因此，卡那霉素不適合作為刺芹側耳遺傳轉化的篩選抗生素進行使用。

潮霉素是植物中應用較廣泛的篩選抗生素，其作用機理是潮霉素可以穩定核糖體大亞基上的tRNA結合位點，導致空載tRNA不能脫離核糖體，進而影響細胞蛋白質的翻譯，從而抑制植物細胞的形成和生長[15]。本研究發現，刺芹側耳菌絲對潮霉素異常敏感，濃度為50 mg/L的潮霉素即能完全抑制菌絲生長，而攜帶潮霉素抗性基因hpt的載體可編碼一種潮霉素磷酸轉移酶，這種酶可使潮霉素發生磷酸化而失活，從而使轉化子不受潮霉素的毒害作用，最終達到篩選目的[16]。因此，潮霉素可以作為刺芹側耳遺傳轉化的篩選抗生素進行使用。

在食用菌的遺傳轉化試驗中，攜帶載體的根癌農桿菌侵染完成后需清除多余的根癌農桿菌，避免影響受體菌絲的正常生長。而氨芐青霉素和頭孢噻肟鈉均可抑制根癌農桿菌的生長，且在本研究中發現，在不同試驗濃度下，氨芐青霉素和頭孢噻肟鈉均對刺芹側耳菌絲生長沒有抑制效果，在一定濃度下反而能促進菌絲生長。因此，在刺芹側耳遺傳轉化研究中，可選擇氨芐青霉素和頭孢噻肟鈉用于抑制根癌農桿菌生長。