玉扇愈傷組織分化培養(yǎng)基的適宜激素濃度篩選試驗

張青華 董月霞 高文瑛 張應(yīng)華 許 彬*

（1云南農(nóng)業(yè)大學園林園藝學院，昆明 650201；2上海市農(nóng)業(yè)科技服務(wù)中心，上海 200335；3云南農(nóng)業(yè)大學滇臺中心，昆明 650201）

玉扇（HaworthiatruncataSch?nland）是百合科十二卷屬植物，葉片對生、形如扇子，是一類觀賞價值高、經(jīng)濟效益好的小型多肉植物，同時，它還具有一定的食用、藥用價值[1]。玉扇的主要繁殖方式一般為嫁接、分株、葉片扦插等[2]，但這幾種繁殖方式的繁殖率較低、數(shù)量少，且由于植株生長緩慢，會導(dǎo)致種苗稀缺而無法滿足市場需求，從而導(dǎo)致玉扇的市場價格居高不下[3-4]。因此，采用組織培養(yǎng)技術(shù)進行玉扇繁育具有重要的現(xiàn)實意義。為此，筆者對玉扇組織培養(yǎng)過程中愈傷組織分化環(huán)節(jié)的培養(yǎng)基適宜激素濃度進行了研究，以期篩選出適宜玉扇愈傷組織分化的培養(yǎng)基配方，從而優(yōu)化玉扇組織培養(yǎng)條件。現(xiàn)將相關(guān)試驗結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 愈傷組織誘導(dǎo)

以玉扇花莖作為外植體，切取尚未開放的花莖，取下后用75%酒精消毒30 s，再用0.1%升汞處理10 min，用無菌水清洗5次后，用無菌濾紙吸干，然后切成1 cm莖段，接種到MS+NAA 0.2 mg/L+6-BA 1.5 mg/L培養(yǎng)基上進行愈傷組織誘導(dǎo)，培養(yǎng)條件為溫度25 ℃、光照3 000 lux、光照時間12 h/d，培養(yǎng)時間為50 d。

1.2 試驗設(shè)計

依據(jù)激素NAA（A因素）及TDZ（B因素）的不同濃度，設(shè)置玉扇愈傷組織分化的培養(yǎng)基配方，見表1。除激素濃度不同外，其他成分均相同，均為MS培養(yǎng)基+蔗糖3%+瓊脂6.4 g/L。試驗分2次進行，第1次試驗進行處理（1）至處理（9），第2次試驗進行處理（10）至處理（18）。

表1 培養(yǎng)基配方激素濃度設(shè)計

每個處理配制10瓶培養(yǎng)基，將誘導(dǎo)獲得的玉扇愈傷組織切成1.0 cm×1.0 cm塊狀，每個瓶內(nèi)均勻放置4塊。培養(yǎng)條件為溫度21～23 ℃、光照強度1 800 lux、光照時間15 h/d，培養(yǎng)時間為50 d。試驗期間觀察記錄各培養(yǎng)基配方處理的玉扇愈傷組織生長分化情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 第1次試驗

據(jù)調(diào)查觀察，在第1次試驗過程中，存在玉扇愈傷組織增殖和分化同時進行的情況，但程度不明顯。從誘導(dǎo)結(jié)果來看，處理（1）至處理（9）的不定芽分化情況均較差，經(jīng)分析，應(yīng)適當增加培養(yǎng)基配方中的TDZ濃度。

2.2 第2次試驗

在第1次試驗的基礎(chǔ)上進行第2次試驗。據(jù)調(diào)查分析，在第2次試驗過程中，玉扇愈傷組織的增殖和分化同時進行，但增殖出現(xiàn)較早，培養(yǎng)約20 d后開始增殖，分化出不定芽較晚，培養(yǎng)約40 d后啟動分化，培養(yǎng)50 d后形成不定芽。由表2可知，處理（10）、處理（14）的玉扇愈傷組織分化率較高，分化出的不定芽器官完整度也較好；處理（11）、處理（15）、處理（17）、處理（18）的玉扇愈傷組織分化率低，總體分化效果較差，且處理（11）、處理（15）的玉扇愈傷組織整體發(fā)黃、偏褐色，愈傷組織活力低；處理（12）、處理（15）的玉扇愈傷組織玻璃化現(xiàn)象嚴重，且愈傷組織分化較慢，衰退現(xiàn)象明顯。

表2 不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基的玉扇愈傷組織分化情況

由表3可知，A、B兩因素交叉互作對玉扇愈傷組織分化率的影響顯著。經(jīng)LSD法多重比較分析，玉扇愈傷組織分化率在5%顯著水平下，處理（14）和處理（10）間差異不顯著，處理（14）與其他處理之間存在顯著差異，見表2。

表3 不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基的玉扇愈傷組織分化率方差分析

經(jīng)綜合分析，處理（14）的玉扇愈傷組織活力高、分化率高（為35.9%），啟動分化時間較早，且分化出的不定芽器官完整度好。因此，玉扇愈傷組織分化環(huán)節(jié)的最佳培養(yǎng)基配方為MS+NAA 0.05 mg/L+TDZ 1.00 mg/L+蔗糖3%+瓊脂6.4 g/L。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié) 論

TDZ作為外源激素與NAA配合使用，有利于誘導(dǎo)玉扇愈傷組織分化，其最佳培養(yǎng)基配方為MS+NAA 0.05 mg/L+TDZ 1.00 mg/L+蔗糖3%+瓊脂6.4 g/L。在此培養(yǎng)基上，玉扇愈傷組織分化率為35.9%，分化情況好，產(chǎn)生的不定芽數(shù)量多，且啟動分化時間較早。

3.2 討 論

3.2.1 TDZ對玉扇愈傷組織分化不定芽的影響

在本試驗中發(fā)現(xiàn)，TDZ作為外源激素與NAA配合使用，其濃度較低時對玉扇愈傷組織分化不定芽的效果不明顯。經(jīng)查閱相關(guān)資料，TDZ雖然對不定芽的產(chǎn)生起一定作用，但玉扇愈傷組織在誘導(dǎo)分化過程中對TDZ的吸收極少，故低濃度的TDZ對玉扇愈傷組織分化不定芽的效果較差，這一結(jié)果與王關(guān)林等[5]的研究結(jié)論一致。在第2次試驗中，筆者適當增大了培養(yǎng)基中TDZ的濃度，發(fā)現(xiàn)玉扇愈傷組織的總體分化效果、增殖情況和分化不定芽的數(shù)量都有顯著提高，但也出現(xiàn)了愈傷組織發(fā)黃、偏褐色的現(xiàn)象，這表明TDZ只有在適宜的濃度范圍內(nèi)，才能較好地誘導(dǎo)玉扇愈傷組織分化不定芽，這一結(jié)果與徐曉峰等[6]的研究結(jié)論一致。因此，在對玉扇愈傷組織誘導(dǎo)分化不定芽時，不僅需要在培養(yǎng)基中加入合適濃度的TDZ，而且還要適宜減少培養(yǎng)時間，改善因培養(yǎng)時間過長而導(dǎo)致的愈傷組織顏色淡化和活力衰退的現(xiàn)象。

3.2.2 TDZ和6-BA對玉扇愈傷組織分化結(jié)果的比較分析

本試驗結(jié)果表明，用TDZ誘導(dǎo)玉扇愈傷組織分化時啟動時間較早，但TDZ濃度過低，則總體分化效果較差；TDZ濃度較高時，分化出的不定芽數(shù)量較多，但愈傷組織顏色發(fā)黃、偏褐色。而筆者在前期研究中發(fā)現(xiàn)，用6-BA誘導(dǎo)玉扇愈傷組織分化，啟動時間較晚，愈傷組織長勢好，顏色較綠，分化出的不定芽數(shù)量較多，且有新植株產(chǎn)生，但玻璃化現(xiàn)象較嚴重。總體來說，6-BA誘導(dǎo)玉扇愈傷組織分化的效果、愈傷組織的活力、分化出的不定芽數(shù)量均較TDZ好，但TDZ誘導(dǎo)玉扇愈傷組織分化的啟動時間比6-BA早，且玻璃化現(xiàn)象輕。

3.2.3 玉扇愈傷組織玻璃化現(xiàn)象產(chǎn)生的原因

在培養(yǎng)過程中，玉扇愈傷組織玻璃化現(xiàn)象較為普遍，愈傷組織玻璃化時呈透明或半透明狀顆粒，且其生長、增殖和分化功能明顯降低。研究表明，玻璃化現(xiàn)象產(chǎn)生的原因有很多，例如，郭生虎等[7]認為外植體、激素種類和濃度、蔗糖和瓊脂的含量、培養(yǎng)條件等，都與玻璃化的產(chǎn)生相關(guān)。而本試驗中，激素濃度是玉扇愈傷組織出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象的主要原因，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，TDZ濃度較低時，愈傷組織玻璃化現(xiàn)象產(chǎn)生明顯；TDZ濃度較高時，愈傷組織玻璃化現(xiàn)象減弱。同時，前人試驗表明，葡萄的玻璃化程度隨著TDZ與乙烯混合濃度的增加而增強[5]，這一結(jié)論與本試驗結(jié)果相反。因此，TDZ的濃度對玉扇愈傷組織玻璃化現(xiàn)象產(chǎn)生的影響還需進一步探討。