大鼠心臟驟停后行心肺復(fù)蘇對海馬腦組織的影響及機(jī)制

夏 威，戴錦辰，周文瀚，陳萌檬，楊 旻，陳曉宇

(安徽醫(yī)科大學(xué) 1.第二附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科， 安徽 合肥 230601； 2. 臨床醫(yī)學(xué)院、3.形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，安徽 合肥 230032)

心臟驟停(cardiac arrest，CA)是臨床較為常見的急危重癥，隨著心肺復(fù)蘇(ceardiopulmonary resuscitation，CPR)技術(shù)的推廣和應(yīng)用，CA患者的自主血液循環(huán)恢復(fù)率和存活率顯著增加，但CA患者常出現(xiàn)神經(jīng)功能損傷，故腦復(fù)蘇在心肺復(fù)蘇后非常重要[1]。CPR后的患者存在缺血/再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury，IRI)，腦組織對機(jī)體缺血缺氧最為敏感[2]。在CA和CPR過程中，患者經(jīng)歷嚴(yán)重缺血缺氧/再灌注的應(yīng)激性病理過程，氧化應(yīng)激損傷始終貫穿在該病理變化進(jìn)程中[3]。氧化應(yīng)激與很多疾病的發(fā)病有關(guān)，線粒體產(chǎn)生的活性氧(reactive oxygen species，ROS)升高，機(jī)體內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)的平衡遭受破壞，抗氧化失衡現(xiàn)象[4]。核因子E2相關(guān)因子(NF-E2-related factor 2，Nrf2)是氧化應(yīng)激的關(guān)鍵轉(zhuǎn)活因子，結(jié)合Kelch 樣ECH相關(guān)蛋白1 (Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1)后，可恢復(fù)機(jī)體氧化失衡的狀態(tài)[5]。CPR后IRI存在急性腦缺血疾病和氧化應(yīng)激損傷，但Nrf2-Keap1信號通路在心臟驟停后腦損傷的機(jī)制研究中文獻(xiàn)報(bào)道較少，該研究從海馬線粒體結(jié)構(gòu)改變方面探討大鼠心臟驟停后，實(shí)施心肺復(fù)蘇術(shù)對大鼠海馬腦組織的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑動(dòng)物呼吸機(jī)(ALC-V9型，北京吉安得爾)，激光共聚焦顯微鏡(德國Leica公司)，透射電鏡(日本 Hitachi公司)，生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(BL-420F，成都泰盟科技)，全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)，熒光定量PCR儀(美國ABI 公司)，電泳和凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad 公司)。依達(dá)拉奉注射液(西安利君制藥，批號H20120042)，羊抗鼠Nrf2、羊抗鼠Keap1、兔抗鼠β-actin多隆抗體(美國Abcam公司，批號分別為ab137550、ab118285、ab10005)，丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)檢測試劑盒(南京建成生物，批號分別為A003-1-2、A001-3-2)，TRIzol試劑(美國Invitrogen公司，批號15596-018)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京聚美生物，批號RP1200)。

1.2 動(dòng)物模型制備成年雄性SD大鼠40只，清潔級，體質(zhì)量(290±20)g，購于安徽省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(皖動(dòng)準(zhǔn)201901號)，在通風(fēng)透氣25 ℃環(huán)境溫度條件，白天黑夜各12 h交替，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn)。SD大鼠隨機(jī)均分為對照組(10只)和模型組(30只)，大鼠CA/CPR模型制備采用窒息法，參照文獻(xiàn)[6]，將大鼠麻醉后，氣管插管，建立人工通氣，夾閉氣管插管使大鼠窒息，大鼠動(dòng)脈血壓≤20 mmHg，心率消失時(shí)，模型組實(shí)施心臟驟停10 min；心肺復(fù)蘇組實(shí)施心臟驟停3 min后行心肺復(fù)蘇操作，包括人工大鼠胸外按壓，機(jī)械通氣等，使得大鼠動(dòng)脈血壓≥60 mmHg，心率≥100 次/min，且血壓和心率逐漸平穩(wěn)，證實(shí)心肺復(fù)蘇完成。對照組SD大鼠行麻醉、氣管插管等操作，但不實(shí)施氣管夾閉和心肺復(fù)蘇等操作。依達(dá)拉奉組在實(shí)施心臟驟停3 min后，靜脈注射依達(dá)拉奉注射液3 mg·kg-1，各組10 min后處死大鼠，每組取3只大鼠腦組織做蘇木素-伊紅(htoxylin eosin，HE)染色病理組織學(xué)評分，2只大鼠海馬組織電鏡觀察線粒體等結(jié)構(gòu)改變，余下5只大鼠海馬組織置-80 ℃做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 血清氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測心肺復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，在大鼠處死前，每只大鼠抽取靜脈血5 mL置離心管中，5 000 r·min-1離心10 min后，分離血清，取上清液放置于-20 ℃冰箱待測。嚴(yán)格按照試劑盒操作說明書檢測大鼠血清反映氧化應(yīng)激指標(biāo)，應(yīng)用硫代巴比妥酸法測定血清MDA 含量，羥胺法測定血清SOD活性，應(yīng)用全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測532 nm處的吸光度值。

1.4 HE染色觀察大鼠海馬腦組織病理學(xué)檢查大鼠腦組織置10%福爾馬林溶液固定24 h，流水沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明、石蠟包埋，厚5 μm切片，HE染色，光鏡下尋找海馬部位，觀察其中神經(jīng)元結(jié)構(gòu)變化病理學(xué)改變。在×40物鏡下，每張切片隨機(jī)挑選3個(gè)視野，計(jì)數(shù)受損神經(jīng)元占整個(gè)視野神經(jīng)元百分比(%)。

1.5 電鏡觀察大鼠海馬結(jié)構(gòu)準(zhǔn)確選取約1×1×1 mm3各組大腦海馬腦組織，3%戊二醛溶液固定12 h，鋨酸后固定，梯度乙醇脫水，丙酮透明，812樹脂包膜，超薄切片，電鏡觀察并攝片。電鏡下對線粒體超微結(jié)構(gòu)觀察，了解海馬神經(jīng)元線粒體膜、基質(zhì)和嵴等結(jié)構(gòu)改變。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR觀察大鼠海馬實(shí)驗(yàn)采取實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real - time PCR)觀察大鼠海馬組織中Nrf2、Keap1 mRNA表達(dá)，取上述各組大鼠海馬腦組織，加入適量TRIzol，提取并測定總RNA濃度，cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄，引物由上海生工公司合成，引物序列如下：Nrf2 mRNA 正鏈5′-CTCCTTAGACTCAAATCCCACCTT-3′，反鏈5′-GGACAGATCACAAGCCCTCAAT-3′，長度163 bp；Keap1 mRNA 正鏈5′-AACTCGGCAGAATGTTACTACCC-3′，反鏈5′-CTACGAAAGTCCAGGTCTCTGTCTC-3′，長度190 bp；內(nèi)參照β-actin mRNA 正鏈5′-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3′，反鏈5′-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3′，長度239 bp。進(jìn)行熒光RT-PCR，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用2-ΔΔCT相對定量法作統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

1.7 Western blot檢測大鼠海馬腦組織中Nrf2-Keap1表達(dá)將凍存的大鼠海馬組織取出后，適量蛋白裂解液組織勻漿，冷凍離心機(jī)10 000 r·min-1×10 min離心，取上清液并定量總蛋白。行SDS-PADGE凝膠電泳時(shí)上樣量為50 μg，電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入特異性一抗(Nrf2濃度1 ∶2 000，Keap1濃度1 ∶1 500，β-actin濃度1 ∶2 500)，4 ℃孵育過夜，TBST漂洗，二抗室溫孵育1 h，TBST漂洗后顯色。用ImageJ軟件進(jìn)行灰度分析，結(jié)果以目的蛋白與β-actin相對表達(dá)量表示。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo)比較與對照組比較，模型組大鼠血清MDA含量顯著升高，SOD活性顯著下降，兩組比較差異有顯著性(P<0.01)；與模型組比較，心肺復(fù)蘇組和依達(dá)拉奉注射組大鼠血清MDA含量顯著下降，SOD活性顯著上升，兩組比較差異有顯著性(P<0.05，P<0.01)。見Tab 1。

Tab 1 Effect of MDA content and SOD activity in serum of

2.2 大鼠海馬腦組織病理學(xué)變化海馬受損神經(jīng)元的病理結(jié)構(gòu)改變包括細(xì)胞質(zhì)中Nissl 體減少，胞質(zhì)空泡化和細(xì)胞核固縮。對照組大鼠海馬腦組織神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)完整，細(xì)胞核位于中央，核仁清楚，胞質(zhì)中充滿Nissl體。模型組海馬腦組織細(xì)胞輪廓不清，細(xì)胞質(zhì)中Nissl體明顯減少，細(xì)胞水腫明顯，受損神經(jīng)元較正常組明顯增多(P<0.01)。心臟驟停后心肺復(fù)蘇組和依達(dá)拉奉組海馬神經(jīng)元形態(tài)稍不規(guī)則，部分神經(jīng)元胞質(zhì)中Nissl體消失，細(xì)胞間隙輕度增加，發(fā)現(xiàn)水腫較缺血組明顯好轉(zhuǎn)，進(jìn)行受損神經(jīng)元百分比計(jì)數(shù)，取平均值，受損神經(jīng)元較缺血組明顯好轉(zhuǎn)(P<0.01)。見Fig 1。

Fig 1 Hippocampal pathological changes of rats in each group (HE×400)A: Normal group; B: Ischemia group; C: Cardiopulmonary resuscitation group; D: Edaravone Group; E: Statistical chart. Note: ##P<0.01 vs Normal group；**P<0.01 vs Ischemia group

2.3 電鏡觀察大鼠海馬超微結(jié)構(gòu)電鏡下，對照組大鼠海馬神經(jīng)元線粒體結(jié)構(gòu)正常，可見明顯的線粒體膜和嵴狀突起；心臟驟停的缺血組大鼠海馬神經(jīng)元線粒體損傷明顯，表現(xiàn)為線粒體體積增大、腫脹，膜和線粒體嵴斷裂，空泡狀；心肺復(fù)蘇組和依達(dá)拉奉組線粒體結(jié)構(gòu)改善明顯，見Fig 2。

2.4 RT-PCR觀察大鼠海馬Nrf2、Keap1 mRNA表達(dá)采用RT-PCR法觀察各組大鼠海馬組織中Nrf2 mRNA、Keap1 mRNA和β-actin mRNA的表達(dá)情況，結(jié)果見Fig 3所示。抗氧化調(diào)控因子Nrf2 mRNA、Keap1 mRNA的檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，模型組Nrf2 mRNA/β-actin mRNA、Keap1mRNA/β-actin mRNA相對表達(dá)量顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，心肺復(fù)蘇組和依達(dá)拉奉組Nrf2 mRNA/β-actin mRNA、Keap1 mRNA/β-actin mRNA表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。提示心臟驟停后，心肺復(fù)蘇過程中氧化應(yīng)激可能是通過上調(diào)抗氧化基Nrf2 mRNA的表達(dá)，下調(diào)Keap1 mRNA表達(dá)。

Fig 2 Ultrastructural changes of hippocampal pathology in each group (EM×2 400)A: Control group; B: Ischemia group; C: Cardiopulmonary resuscitation group; D: Edaravone Group

Fig 3 Relative expression levels of hippocampal Nrf2 and Keap1 genes in rats n=3)*P<0.05 vs Ischemia group; ##P<0.01 vs Control group

2.5 大鼠海馬腦組織中Nrf2-Keap1蛋白表達(dá)采用Western blot法觀察各組大鼠海馬組織中氧化應(yīng)激蛋白Nrf2和Keap1的表達(dá)情況，結(jié)果見Fig 4所示。與對照組大鼠比較，模型組大鼠海馬中Nrf2/β-actin、Keap1/β-actin蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，心肺復(fù)蘇組和依達(dá)拉奉組Nrf2/β-actin、Keap1/β-actin 蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。

Fig 4 Relative expression levels of hippocampal Nrf2 and Keap1 protein in ratsA: Typical protein expression, B: Statistical n=3)； ##P<0.01 vs Control group, *P<0.05 vs Ischemia group

3 討論

決定心跳驟停后患者行心肺復(fù)蘇過程效果的重要因素之一是腦復(fù)蘇，但其療效有限，是全球性難以解決的問題。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，美國院外每年約有30萬心跳驟停患者，超過半數(shù)患者出現(xiàn)死亡，主要是由于患者神經(jīng)系統(tǒng)出現(xiàn)不可逆性受損[6]。CPR后，患者全身器官存在缺血/再灌注損傷，而大腦對缺血缺氧較為敏感，而且腦組織中海馬與學(xué)習(xí)記憶有關(guān)，與患者預(yù)后關(guān)系密切[7]。故本研究重點(diǎn)觀察心跳驟停后大鼠行心肺復(fù)蘇的海馬結(jié)構(gòu)變化，研究表明，模型組海馬中損傷的神經(jīng)元明顯增多，細(xì)胞質(zhì)中Nissl 體減少，表明神經(jīng)遞質(zhì)合成減少；而心臟驟停后心肺復(fù)蘇組受損神經(jīng)元數(shù)目較缺血模型組明顯減少，神經(jīng)元胞質(zhì)中Nissl體含量明顯增多，心跳驟停后及時(shí)體外按壓，促使心肺復(fù)蘇，可以促進(jìn)大鼠自主循環(huán)重新建立，恢復(fù)全身組織器官，尤其是腦組織的供血供氧，故早期進(jìn)行心肺復(fù)蘇有利于神經(jīng)系統(tǒng)功能恢復(fù)。在缺血/再灌注的應(yīng)激反應(yīng)過程中，機(jī)體產(chǎn)生大量氧自由基，依達(dá)拉奉也有一定的清除氧自由基功能，減輕神經(jīng)細(xì)胞凋亡，從而降低氧化應(yīng)激反應(yīng)，且有報(bào)道顯示，依達(dá)拉奉能夠增加缺血腦組織中神經(jīng)生長因子，降低腦損傷[8]，故本研究將其選為陽性對照藥。

臨床上，如何降低CPR 后腦損傷，改善患者生存質(zhì)量。缺血/再灌注引起機(jī)體氧自由基(ROS)增多，ROS具有強(qiáng)氧化作用，化學(xué)性質(zhì)活潑，引起細(xì)胞膜和細(xì)胞器膜骨架成分改變，造成細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損。ROS促使脂質(zhì)過氧化反應(yīng)而破壞膜結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致膜通透性升高，細(xì)胞膜上Na+/Ca2+交換功能紊亂，引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，激活磷脂酶類，破壞細(xì)胞器膜結(jié)構(gòu)，加重細(xì)胞腫脹[9]。線粒體是細(xì)胞內(nèi)氧化磷酸化供能的細(xì)胞器，是反映細(xì)胞內(nèi)缺氧損傷的中心結(jié)構(gòu)；腦缺血缺氧時(shí)，線粒體氧化磷酸化的代謝底物氧、糖等衰竭，神經(jīng)元膜電位難以維持，電壓依賴性鈣通道開放，細(xì)胞鈣離子內(nèi)流導(dǎo)致鈣超載，同時(shí)，線粒體為機(jī)體產(chǎn)生內(nèi)源性活性氧的主要部位，鈣超載等降低線粒體電子傳遞鏈，引起ROS增多，破壞線粒體膜磷脂，使細(xì)胞能量代謝進(jìn)一步出現(xiàn)障礙[10]。本研究通過檢測大鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)心跳驟停大鼠存在氧化應(yīng)激情況，表現(xiàn)為血清MDA升高，SOD活性下降，而心肺復(fù)蘇后，大鼠血清MDA含量下降，SOD活性上升，表明心肺復(fù)蘇降低了大鼠心跳驟停后氧化應(yīng)激損傷。同時(shí)，本研究通過透射電鏡也證實(shí)了海馬神經(jīng)元中線粒體參與該損傷修復(fù)過程，表現(xiàn)為心臟驟停的缺血大鼠海馬神經(jīng)元線粒體損傷明顯，線粒體嵴斷裂，空泡狀，而心肺復(fù)蘇后線粒體結(jié)構(gòu)改善明顯。

鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子家族成員Nrf2可調(diào)控抗氧化反應(yīng)原件，Keap1是Nrf2胞質(zhì)蛋白伴侶分子，Nrf2是機(jī)體細(xì)胞抗氧化損傷的關(guān)鍵因子，正常情況下，Nrf2可修復(fù)細(xì)胞損傷，Nrf2與Keap1以二聚體形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，并達(dá)到相對平衡狀態(tài)；在氧化應(yīng)激損傷等刺激后，Nrf2與Keap1解離，激活下游抗氧化反應(yīng)，提高細(xì)胞抗氧化應(yīng)激功能[11]。心臟驟停產(chǎn)生的應(yīng)激對機(jī)體組織細(xì)胞形成極強(qiáng)的刺激，促進(jìn)呼吸爆發(fā)活性，激活氧化信號通路Nrf2-Keap1中相關(guān)基因的活性。本研究表明，通過檢測大鼠海馬組織中與抗氧化相關(guān)基因的Nrf2 mRNA和Keap1 mRNA表達(dá)，以及進(jìn)一步在蛋白水平上進(jìn)行Nrf2、Keap1檢測，均得到一致的結(jié)果，證實(shí)心臟驟停后，實(shí)施心肺復(fù)蘇對大鼠海馬腦組織Nrf2、Keap1 蛋白表達(dá)降低，緩解氧化應(yīng)激損傷。

綜上，心臟驟停后，大鼠機(jī)體會(huì)出現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷，表現(xiàn)為海馬腦組織損傷，線粒體結(jié)構(gòu)出現(xiàn)較為嚴(yán)重的破壞，心肺復(fù)蘇可部分逆轉(zhuǎn)該破壞，其機(jī)制與降低氧化應(yīng)激損傷Nrf2/Keap1蛋白等有關(guān)。

(本研究在安徽醫(yī)科大學(xué)人體形態(tài)實(shí)驗(yàn)中心完成，感謝給予幫助的老師和同學(xué)們)