分子篩輔助人參須根粉快速制備人參皂苷Rg5的工藝研究

葉安琪，張浩然**，張躍偉*，李 玲，成樂琴*

(1.吉林化工學院 化學與制藥工程學院,吉林 吉林 132022；2.吉林省彩森仁生物科技有限責任公司,吉林 吉林 132022)

人參(Panax ginseng C.A.Mey)屬五加科草本植物[1]，是一種傳統的中草藥，因根形似人而得名，主要生長在中國、韓國和日本等亞洲國家，現被世界各地廣泛使用已有數千年的歷史[2-3].人參皂苷是其主要成分之一，含量在4%左右[4-5]，目前有123種人參皂苷已被鑒定[6].近年來，國內外對人參皂苷的藥理作用及其分子機制進行了大量的研究，稀有人參皂苷的藥用潛力逐漸被發現[7-9].稀有人參皂苷Rg5是蒸參的主要成分之一[10]，常用于預防和治療各種疾病，如糖尿病、癌癥、免疫力過低以及記憶阻礙和過敏性疾病等[11-16].由于蒸參過程通常需要比較長的時間，操作繁瑣，而且對制備特定皂苷的選擇性較差，因此如何由人參須根粉快速制備稀有人參皂苷Rg5凸顯出其重要價值.

實驗研究發現，在稀有人參皂苷Rg5的制備中加入殼聚糖、皂土等作吸附劑，可以有效提高人參皂苷Rg5的收率[17].分子篩是一種結晶型的硅鋁酸鹽，他的表面積大、孔結構規整，具有良好親水性能，可作為吸附劑、催化劑和催化劑載體.前期探索實驗表明，分子篩與殼聚糖、皂土等吸附劑一樣也顯示出良好的人參皂苷Rg5的抑制作用.本實驗研究在分子篩輔助下，利用多功能改進型索氏提取器從人參須根粉中高效提取制備人參皂苷Rg5的制備工藝，并進行工藝優化，為人參皂苷Rg5的低成本、快速制備提供技術支持.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

人參須根粉(純度≥80%)：吉林省通化市彩森仁生物有限公司提供；人參皂苷Re、Rg5對照品(純度≥98%)：成都曼斯特公司；A型分子篩(使用前研細，900 ℃活化2 h)；乙腈(色譜純)：瑞典歐森巴克化學公司；純凈水，杭州哇哈哈集團有限公司；甲醇(色譜純)、正丁醇、高氯酸等溶劑(國產分析純)：天津大茂化學試劑廠；香草醛(分析純)：天津市光復精細化工研究所；冰乙酸(分析純)：天津市福晨化學試劑廠.

多功能改進型索氏提取器：自制(結構見ZL201720660247.5)；高效液相色譜儀：大連依利特分析儀器有限公司；色譜柱Pinnacle Ⅱ C18：RESTEK U.S.的250 mm×4.6 mm，5 μm；紫外分光光度計(760CRT)：上海儀電儀器有限公司；高速離心機(H2050R)：湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；旋轉蒸發儀(RE202)：日本Yamato；智能磁力攪拌器(ZNCL-GS)：鄭州市亞榮儀器有限公司.

1.2 實驗原理

具體實驗原理見圖1.

圖1 人參皂苷Rg5的制備原理

1.3 實驗方法

1.3.1 紫外-可見分光光度法測定人參須根總皂苷含量

(1) 人參皂苷Re對照品溶液的制備

精密稱取人參皂苷Re對照品3.3 mg，加色譜純甲醇定容至10 mL，得濃度為0.33 mg·mL-1的人參皂苷Re對照品溶液.

(2) 標準曲線的繪制

精密移取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL人參皂苷Re對照品溶液于10 mL的具塞試管中，70 ℃水浴中蒸干.于每個具塞試管中加入新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL，高氯酸0.8 mL，60 ℃水浴加熱15 min后準確加入5 mL冰醋酸搖勻，在400～800 nm全波長掃描中顯示最大吸收的542 nm波長處測定吸光度值(A)，以人參皂苷Re濃度(C，μg·mL-1)為橫坐標，吸光度(A)為縱坐標，繪制標準曲線.

1.3.2 液相色譜分析法測定人參皂苷Rg5的含量

(1) 人參皂苷Rg5對照品溶液的制備

精密稱取人參皂苷Rg5對照品3.0 mg，加色譜純甲醇定容至10 mL，得濃度為0.30 mg·mL-1的人參皂苷Rg5對照品溶液.

(2) 標準曲線的繪制

精密移取0.2、0.5、1.0、2.5 mL人參皂苷Rg5對照品溶液于10 mL容量瓶中，用色譜純甲醇定容配成不同已知濃度的人參皂苷Rg5對照品溶液，經0.45 μm濾膜過濾后，進行HPLC分析，并以人參皂苷Rg5濃度(C，μg·mL-1)為橫坐標，峰面積(mV)為縱坐標，繪制標準曲線.

(3) HPLC分析條件

色譜條件[18]：流速:1.0 mL/min；檢測波長：203 nm；柱溫：35 ℃；進樣量：20 μL；流動相為：(A)乙腈，(B)水.梯度洗脫程序：0.00～10.00 min，A：22%；10.00～20.00 min，A:22%；20.00～25.00 min，A:27%；25.00～45.00 min，A:31%；45.00～60.00 min，A:38%；60.00～65.00 min，A:52%；65～75 min，A:52%；75.00～82 min，A:55%；82.00～82.10 min，A:60%；82.10～100.00 min，A:90%；100.00～100.10 min，A：90%；100.10～120.00 min，A：22%.

1.3.3 單因素考察

在自制多功能改進型索氏提取器的提取筒中加入2.0 g人參須根粉和10 mL甲醇，蒸餾瓶中加入30 mL甲醇和350 μL濃鹽酸，再分別加入3A、4A、5A分子篩0.3 g，設定提取筒溫度為70 ℃，恒溫油浴鍋溫度110 ℃，轉速300 rpm條件下加熱提取人參須根粉4 h.當提取筒中開始有回流液時，調節提取筒活塞使回流液與提取溶劑氣化均衡.提取結束后，冷卻靜置、離心，取上清液，得人參提取液.移取人參提取液40 μL，置于10 mL的具塞試管中，按1.3.1(2)方法進行樣品處理得供試品溶液1，在542 nm波長處測定吸光度值(A)，利用紫外-可見分光光度法測定人參須根總皂苷含量.準確移取1/25人參提取液，調節pH至6～7，旋蒸至干，溶于4 mL色譜純甲醇得供試品溶液2，利用HPLC分析進行人參皂苷Rg5的含量測定.

(2) 分子篩用量對人參皂苷Rg5的制備影響

在自制多功能改進型索氏提取器的蒸餾瓶中，分別加入0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 g 的4A分子篩，其他條件不變，依照“1.3.3 (1)”項方法提取制備人參皂苷Rg5，并進行人參總皂苷和人參皂苷Rg5的含量測定.

(3) 溶劑用量對人參皂苷Rg5的制備影響

在自制多功能改進型索氏提取器的蒸餾瓶中，分別加入20、25、30、35、40 mL甲醇溶液，其他條件不變，依照“1.3.3 (1)”項方法提取制備人參皂苷Rg5，并進行人參總皂苷和人參皂苷Rg5的含量測定.

(4) 提取筒溫度對人參皂苷Rg5的制備影響

在自制多功能改進型索氏提取器中，分別改變提取筒溫度為55、60、65、70、75 ℃，其他條件不變，依照“1.3.3 (1)”項方法提取制備人參皂苷Rg5，并進行人參總皂苷和人參皂苷Rg5的含量測定.

青海省藏羊主要集中在海北的祁連縣、天峻縣、興海縣、同德縣和玉樹州、果洛州。早期，青海藏羊主要以產毛為主，飼養管理粗放，產肉性能較低。近年來，由于羊毛國際市場變化莫測，羊毛價格浮動較大，以產肉為主的藏羊得到重視，肉羊飼養量逐漸加大，青海省藏羊肉資源也隨之增加。隨著藏羊肉資源的日益豐富和青海省科學技術的發展，藏羊肉產業也得到了相應的發展。目前已經開發出了幾種迎合市場需求的藏羊肉產品，包括冷鮮藏羊肉等深加工食品和袋裝羊肉串、速食羊雜等休閑食品。但是，青海省藏羊加工產業發展整體水平相對較低，存在著較為明顯的問題，主要表現在：

(5) 提取時間對人參皂苷Rg5的制備影響

在自制多功能改進型索氏提取器中，分別提取2、3、4、5、6 h，其他條件不變，依照“1.3.3 (1)”項方法提取制備人參皂苷Rg5，并進行人參總皂苷和人參皂苷Rg5的含量測定.

2 結果與討論

2.1 人參皂苷Re標準曲線的繪制

將不同質量人參皂苷Re對照品經5%香草醛-冰醋酸溶液和高氯酸處理后在542 nm處進行吸光度測定，以人參皂苷Re對照品的質量濃度為橫坐標x (μg·mL-1)，以吸光度為縱坐標y(A)，繪制標準曲線(見圖2).

濃度/(μg·mL-1)圖2 人參皂苷Re的標準曲線

根據圖2可知，Re的回歸方程為y=0.023 9x-0.009 1，方程相關系數R2=0.999 5，表明人參皂苷Re在11～55 μg·mL-1濃度范圍內與吸光度的線性關系良好.

2.2 人參皂苷Rg5標準曲線的繪制

將不同濃度人參皂苷Rg5對照品的甲醇溶液經0.45 μm濾膜過濾后在203 nm波長下進行HPLC分析，以人參皂苷Rg5對照品的質量濃度為橫坐標x (μg·mL-1)，以峰面積為縱坐標y(mv)，繪制標準曲線(見圖3).

濃度/(μg·mL-1)圖3 人參皂苷Rg5的標準曲線

根據圖3可知，回歸方程為y=14.274x+ 6.376 1,相關系數R2=0.999 0，表明Rg5濃度在6～300 μg·mL-1范圍內與峰面積的線性關系良好.

2.3 單因素實驗結果分析

2.3.1 分子篩種類對人參皂苷Rg5的制備影響

3A、4A、5A分子篩是3種A型分子篩，所帶金屬離子各不相同，3A是K+型分子篩，而4A和5A是Na+和Ca2+型分子篩.為了考察不同的A型分子篩對制備人參皂苷Rg5的影響，只改變分子篩的種類進行了由人參須根粉制備人參皂苷Rg5的實驗，如表1所示.

表1 分子篩種類對人參皂苷提取的影響

由表1可以看出，在不同A型分子篩的輔助下得到的人參提取物中，人參總皂苷含量沒有明顯區別，但人參皂苷Rg5的得率有顯著差異.實驗結果表明，加入4A分子篩時人參皂苷Rg5的得率為3.13%，明顯高于加入3A分子篩或5A分子篩，說明A型分子篩中因金屬的不同而引起的分子篩的不同結構對Rg5的制備影響較大.因Na+型分子篩(4A分子篩)效果明顯優于K+型分子篩(3A分子篩)及Ca2+型分子篩(5A分子篩)，因此用4A分子篩為輔助試劑進行了進一步的優化實驗.

2.3.2 分子篩的用量對人參皂苷Rg5的制備影響

為了考察4A分子篩的用量對人參皂苷Rg5的制備影響，在其他條件不變條件下，加入0.2～0.6 g分子篩進行了由人參須根粉制備人參皂苷Rg5的實驗，如表2所示.

表2 分子篩用量對人參皂苷提取的影響

由表2可以看出，分子篩用量基本不影響人參總皂苷的含量，但對人參皂苷Rg5的得率影響顯著，分子篩用量過少或過多都不利于人參皂苷Rg5的制備.這是因為分子篩用量減少時，人參皂苷Rg5的分解增多，Rg5得率下降；分子篩用量增多時，提取得到的原人參二醇組皂苷的轉化率下降，Rg5得率下降.結果表明，分子篩用量為0.3 g時人參皂苷Rg5的得率最高.

2.3.3 提取劑用量對人參皂苷Rg5的制備影響

提取劑的用量不僅影響溶質的溶解能力，還會影響酸濃度，從而進一步影響酸對人參皂苷的催化效果.為了考察提取劑的用量對人參皂苷Rg5的制備影響，蒸餾瓶中分別加入20～40 mL溶劑進行人參須根粉的提取實驗，如表3所示.

表3 提取劑用量對人參皂苷提取的影響

由表3可以看出，人參總皂苷的含量隨著提取劑用量的增加略有增大，但人參皂苷Rg5的得率并未因總皂苷含量的增大而同步增大.實驗結果顯示，當提取劑用量為30 mL時，人參皂苷Rg5的得率最高，提取劑用量進一步提高時Rg5得率反而有所下降，這說明提取劑用量過多時，酸濃度會下降，酸催化效果隨之減弱，因此提取的人參皂苷的轉化率降低，致使生成的人參皂苷Rg5減少.

2.3.4 提取筒溫度對人參皂苷Rg5的制備影響

溶質在溶劑中的溶解度與溫度的高低有密切的關系.為了考察提取溫度對制備人參皂苷Rg5的影響，其他條件不變，只改變提取筒溫度進行了人參須根粉的提取實驗，如表4所示.

表4 提取筒溫度對人參皂苷提取的影響

由表4可見，提取筒溫度為55 ℃時，無論是人參總皂苷的含量還是人參皂苷Rg5的得率均為最低；但隨著提取筒溫度升高至60 ℃時，人參總皂苷的含量和人參皂苷Rg5的得率均有所增加；而提取筒溫度進一步升高至60～75 ℃之間時，人參總皂苷的含量無明顯變化，人參皂苷Rg5的得率略有下降.

2.3.5 提取時間對人參皂苷Rg5的制備影響

人參須根粉中提取制備人參皂苷Rg5的過程包含人參皂苷的提取和人參皂苷的轉化過程.人參總皂苷的提取量多，人參皂苷的轉化量多，同時生成的Rg5分解少，才能得到較高得率的人參皂苷Rg5.為了考察提取時間對制備人參皂苷Rg5的影響，在其他條件不變的情況下分別對人參須根粉提取了2～6 h，如表5所示.

表5 提取時間對人參皂苷提取的影響

由表5可知，提取時間為2 h時，提取總皂苷的含量和人參皂苷Rg5的得率均較低，說明提取時間短，提取到的人參總皂苷少，人參皂苷Rg5的得率也隨之變少.當提取時間增至3 h時，總皂苷含量達到峰值，而進一步延長提取時間，總皂苷含量沒有明顯變化，說明提取時間達到3 h時，就可以將人參須根粉中的大部分人參皂苷提取出來.而對于人參皂苷Rg5，當提取時間為4 h時得率達到最大值3.20%，進一步延長提取時間，得率反而明顯下降，這是因為提取時間過長，體系中沒有新的人參皂苷被提取，而人參皂苷Rg5的分解成為主反應，致使Rg5的得率下降.

為了驗證自制多功能改進型索氏提取器在提取人參總皂苷和制備人參皂苷Rg5的效果，在最佳提取條件下，利用多功能改進型索氏提取器及傳統型索氏提取器分別對人參須根粉的進行加熱回流提取.

由圖4的HPLC對比圖可以發現，多功能改進型索氏提取器提取人參須根粉時人參皂苷Rg5的得率是傳統型索氏提取器的1.46倍.這說明利用多功能改進型索氏提取器提取人參皂苷時，對人參皂苷的提取效果明顯優于傳統型索氏提取器.

t/min圖4 不同提取器提取人參皂苷Rg5的HPLC對比圖

3 結 論

本實驗利用多功能改進型索氏提取器，在分子篩輔助下酸催化制備了人參皂苷Rg5.分子篩可以有效抑制人參皂苷Rg5的分解，實現高收率、高效制備稀有人參皂苷Rg5的目的.與傳統型索氏提取器的對比實驗表明，自制多功能改進型索氏提取器提取制備人參皂苷Rg5的得率是傳統型索氏提取器的1.46倍，顯示出非常好的人參皂苷的提取和轉化效果.本工藝將人參皂苷的轉化與提取過程合二為一，同時完成了提取液與人參渣的固液分離，不僅耗時短，且操作方便、快捷，這對于稀有人參皂苷Rg5的大量制備以及相關產品的開發具有重要借鑒意義.