醬香型白酒大曲中功能微生物菌群及其酶系研究進(jìn)展

（貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽 550025）

中國白酒是世界上最古老的蒸餾酒之一，享譽(yù)世界，在中國食品行業(yè)和文化氛圍中也占有重要的地位[1]。中國白酒主要以支鏈淀粉豐富的高粱、谷物為主要原料，以大曲、小曲或麩曲為糖化發(fā)酵劑，采用固態(tài)、半固態(tài)或液態(tài)發(fā)酵方式，經(jīng)蒸煮、發(fā)酵、蒸餾、勾調(diào)和貯存等工藝制得[2-3]。不同的釀酒原料、地理位置、氣候條件、生產(chǎn)工藝造就了中國白酒香型、口感、品質(zhì)及風(fēng)味迥異的特點(diǎn)[4]。

中國白酒行業(yè)中流傳著“糧乃酒之肉，曲乃酒之骨”說法，大曲作為一種以小麥為原料所制得的發(fā)酵培養(yǎng)基，在白酒生產(chǎn)過程中擔(dān)任“微生物制劑、復(fù)合酶制劑和風(fēng)味物質(zhì)載體”等角色，對白酒的生產(chǎn)起到至關(guān)重要的作用[5]。大曲不僅有助于高粱發(fā)酵過程中淀粉的降解及乙醇的產(chǎn)生，還決定了白酒最終的風(fēng)味，一方面，主要是因?yàn)榇笄泻卸喾N能水解和發(fā)酵底物的微生物和所分泌酶，在溫度、濕度滿足生長的條件下，分解谷物生成酒精；另一方面，大曲品質(zhì)很大程度上取決于成分配方和微生物菌群組成，這些因素因產(chǎn)地而異，賦予發(fā)酵酒獨(dú)特的風(fēng)格和品質(zhì)[6]。本文主要闡述醬香大曲功能微生物菌群及分泌酶系等方面內(nèi)容，旨在為大曲微生物的研究提供一定的理論參考，促進(jìn)白酒大曲的生產(chǎn)研究和品質(zhì)提升。

1 醬香大曲功能微生物菌群

醬香型白酒的生產(chǎn)遵循“12987”和“四高”的生產(chǎn)原則，即一年一個生產(chǎn)周期，兩次投料發(fā)酵，九次蒸煮，八次發(fā)酵，七次摘酒，高溫制曲、高溫堆積、高溫發(fā)酵和高溫摘酒，其中高溫制曲是醬香型白酒生產(chǎn)的一大特點(diǎn)。目前，醬香型白酒高溫大曲生產(chǎn)環(huán)境相對開放，確保發(fā)酵溫度適合大曲發(fā)酵，而制曲環(huán)境中空氣、稻草、原料和器皿中微生物都可能參與發(fā)酵，成為大曲中必需微生物。大曲中主要有3類微生物，分別是細(xì)菌、絲狀真菌（霉菌）和酵母菌，此外還含有部分放線菌，但放線菌作用功能目前尚不明確[7]。不同醬香大曲中微生物菌群結(jié)構(gòu)如表1所示。

1.1 醬香大曲中的霉菌種類及作用

通常，醬香型白酒高溫大曲中霉菌主要可分為根霉（Rhizopussp.）、毛霉（Mucorsp.）和曲霉（Aspergillussp.）3 大類，白酒釀造中涉及豐富的霉菌參與發(fā)酵，其中以根霉和毛霉為主。米根霉是醬香大曲中主要根霉，其菌絲一般多核且呈分支狀，菌絲之間沒有明顯的隔膜，在大曲和白酒發(fā)酵過程中產(chǎn)生乙醛、正丙醇、乙酸乙酯、丙酸乙酯等芳香族成分而廣為研究者們所關(guān)注[20]；而曲霉屬于叢梗孢科中的一類，菌絲呈褐、黑、黃、白等顏色，在種類眾多的曲霉微生物中，黑曲霉作為大曲中大量存在的霉菌，已被諸多學(xué)者證明其具有分泌多種活力較強(qiáng)的酶系，一方面霉菌的功能是參與谷物原料中淀粉的糖化、液化；另一方面可產(chǎn)生發(fā)酵所需的多種酶類，如糖化酶、α-淀粉酶和蛋白酶等，推動大曲發(fā)酵成熟，有助于降解大曲原料淀粉，并一定程度上防止曲塊掛衣差、裂口與死板等現(xiàn)象[21-22]。

關(guān)于醬香大曲中霉菌的研究諸多，如陳筆[23]通過涂布平板法和PCR-DGGE 技術(shù)對貴州某醬香型白酒廠大曲曲粉進(jìn)行檢測，兩種方法均檢測到Aspergillus terreus、Aspergillus oryzae和Paecilomyces variotii3 種霉菌，且Aspergillus oryzae和Paecilomy-ces variotii為白酒發(fā)酵過程中優(yōu)勢菌；LIU 等[24]通過DGGE 技術(shù)在醬香型大曲中檢測并分離到M.racemosus和T.crustanceus兩種霉菌。班世棟等[25]從貴州省某酒廠醬香大曲中分離得到19 株霉菌；目前，通過可培養(yǎng)和未培養(yǎng)的方式，從酒曲中分離得到的霉菌主要為7 類約50 種，分別為Aspergillussp.，Absidiasp.，Rhizomucorsp.，Rhizomucorsp.，Mucorsp.，Penicilliumsp.和Monascussp.[23]。WANG 等[26]通過PCR-DGGE 技術(shù)在中國白酒大曲釀造微生物中檢測到Rhizomucor miehei、Absidia blakesleeana、Aspergillus oryzae和Aspergillus terreus4 株霉菌等。

1.2 醬香大曲中的酵母菌種類及作用

酵母菌（Saccharomyces sp.）是大曲發(fā)酵的原動力，在大曲發(fā)酵過程中發(fā)揮著重要的作用。通常，酵母菌以出芽的無性繁殖方式為主，在高溫大曲中主要起到酒化和酯化的作用，不同類型的酵母菌決定不同風(fēng)格的大曲，進(jìn)而影響白酒的品質(zhì)和風(fēng)格[21]。醬香大曲中含有豐富的酵母菌，主要包含釀酒酵母、假絲酵母、產(chǎn)酯酵母等。不同種類的酵母菌可以分泌活性強(qiáng)的酒化酶和酯化酶，促使谷物中的淀粉分解為葡萄糖，葡萄糖進(jìn)一步通過糖酵解途徑分解為乙醇，并通過合成酯賦予酒體重要的風(fēng)味物質(zhì)[27]。

早在2001 年，關(guān)于醬香大曲中酵母菌的研究就已開展，茅臺酒廠技術(shù)中心對茅臺酒制曲發(fā)酵過程中分離得到18 種酵母菌，包括釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、假絲酵母（Candidasp.）、絲孢酵母（Trichosporonsp.）、漢遜酵母（Hansenulasp.）、紅酵母（Rhodotorulasp.）和畢赤酵母（Pichiasp.）等[28]；吳徐建[29]通過現(xiàn)代分子生態(tài)技術(shù)探究醬香大曲中酵母菌，結(jié)果表明，大曲中分離得到熱帶假絲酵母、Candida silvae等不同種類的酵母，其中扣囊復(fù)膜酵母和異常畢赤酵母是大曲中優(yōu)勢酵母種類，而釀酒酵母雖然在大曲中含量較少，但一定程度上豐富了大曲中酵母種類結(jié)構(gòu)；王旭亮等[30]通過研究發(fā)現(xiàn)大曲中含有1 株酵母Sc-1，能夠有效縮短大曲發(fā)酵時間并提高摘酒酒度，此說明大曲不僅能夠提供白酒發(fā)酵過程中所需具有發(fā)酵力作用的釀酒酵母菌株，還能提供協(xié)同促進(jìn)釀酒酵母完成酒精發(fā)酵的其他功能菌；Wu 等[31]通過研究郎酒大曲和酒醅的微生物變化趨勢發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵基質(zhì)堆積初期酵母菌數(shù)量上升，但隨著發(fā)酵時間的推移，酵母菌的數(shù)量會下降；羅方雯等[32]對茅臺鎮(zhèn)醬香型白酒不同釀造區(qū)域可培養(yǎng)酵母種群結(jié)構(gòu)多樣性研究發(fā)現(xiàn)，從大曲中共分離223株酵母，鑒定為12個屬、20個種，其中主要優(yōu)勢種為W.anomalus和Saccharomycopsis fibuligera，此外Nectaromyces rattus、Wickerhamomycessp.H1Y23、Issatchenkiasp.S612Y5、Wickerhamomyces pijperi、Trichosporon faecale、Kazachstaniasp.IMB190R、Pseudozymasp.、Kazachstania solicola、Torulasporasp.Z8Y10 和Helicoceras oryzae為首次從醬香型白酒釀造過程中分離獲得的酵母菌株。

表1 部分醬香型白酒大曲微生物研究近況

續(xù)表1 部分醬香型白酒大曲微生物研究近況

1.3 醬香大曲中的細(xì)菌種類及作用

高溫大曲發(fā)酵過程中，其發(fā)酵形成方式除依賴霉菌之外，多數(shù)還依靠耐高溫細(xì)菌。耐高溫細(xì)菌主要包括乳酸菌（Lactic acid bacteria）、芽孢桿菌（Ba-cillussp.）、醋酸菌（Saccharomycessp.）等。研究發(fā)現(xiàn)，在醬香型白酒高溫大曲的發(fā)酵和糖化過程中，以小麥為原料的高溫大曲微生物細(xì)菌可以降解淀粉和蛋白質(zhì)，生成氨基酸和發(fā)酵型糖類，所以耐高溫細(xì)菌是醬香物質(zhì)產(chǎn)生的重要因素之一。此外，醬香大曲中乳酸菌會消耗和利用大曲原料中營養(yǎng)物質(zhì)產(chǎn)生大量的乳酸，在酶的作用下進(jìn)一步與乙醇生成乳酸乙酯，乳酸乙酯的含量過高，一定程度上會影響白酒酒體的風(fēng)格和品質(zhì)。白酒酒體中常見的異味，如餿味、澀味和酸味等，與大曲參與混合發(fā)酵有密切的聯(lián)系，換而言之，大曲中乳酸菌含量的多少是衡量大曲品質(zhì)的一個重要的指標(biāo)；醋酸菌是大曲產(chǎn)酸的主要菌群之一，能氧化葡萄糖和乙醇，生成乙酸，并進(jìn)一步與醇反應(yīng)生成酯類化合物[21]。探究醋酸菌的種類、數(shù)量及發(fā)酵特點(diǎn)有利于合理控制制曲發(fā)酵進(jìn)程；而芽孢桿菌作為細(xì)菌的一類，屬于需氧菌，適宜在偏酸性、潮濕的環(huán)境中生存，在大曲發(fā)酵過程中，也起到至關(guān)重要的作用。

關(guān)于醬香大曲中細(xì)菌菌群的種類及分布的研究較多，例如，任愛容[15]通過高通量測序結(jié)合數(shù)理分析方法首次在醬香大曲中檢測出細(xì)菌21 個門和532 個屬，首次檢出解硫胺素芽胞桿菌屬（Aneurinibacillus）、魯梅爾芽胞桿菌屬（Rummeliibacillus）、摩根氏菌屬（Morganella）、普勞斯氏菌屬（Prauserella）、橄欖形菌屬（Olivibacter）、庫特氏菌屬（Kurthia）、兩面神菌屬（Janibacter）、巴爾通氏體屬（Bartonella）、香味菌屬（Myroides）、Parapusillimonas和unclassified_o__Corynebacteriales；此外，隨著醬香大曲的發(fā)酵，細(xì)菌多樣性下降，優(yōu)勢菌群變化明顯，其中芽孢桿菌屬（Bacillus）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、片球菌屬（Pediococcus）、魏斯氏菌屬（Weissella）、棒狀桿菌屬（Corynebacterium）、高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）和乳酸桿菌屬（Lactobacillus）是母曲和翻倉曲的優(yōu)勢菌群，而出倉曲的主要菌群為芽孢桿菌屬（Bacillus）和乳酸桿菌屬（Lactobacillus）[33]。醬香大曲的發(fā)酵情況與環(huán)境條件密不可分，其二者所含細(xì)菌菌群的種類也不同，根據(jù)連續(xù)七個輪次的大曲和釀造環(huán)境樣品的分布頻率和優(yōu)勢度分析表明，Bacillus、Lysinibacillus、Staphylococcus和Micrococcus為釀造大曲中的核心可培養(yǎng)細(xì)菌，Bacillus、Staphylococcus、Micrococcus和Alcaligenes為環(huán)境中的核心可培養(yǎng)細(xì)菌，而Bacillus、Staphylococcus和Micrococcus為大曲和環(huán)境樣品中共有的可培養(yǎng)核心細(xì)菌，各輪次大曲與環(huán)境樣品中細(xì)菌種類存在差異，但主要細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)基本保持一致[34]。綜上所述，可培養(yǎng)優(yōu)勢細(xì)菌一方面為茅臺鎮(zhèn)醬香型白酒釀造提供了豐富的生物性資源、豐富的釀造酶系結(jié)構(gòu)，調(diào)控重要風(fēng)味形成；另一方面為高品質(zhì)的醬香白酒釀造提供了凈化、安全的基礎(chǔ)環(huán)境條件。

2 醬香大曲主要功能酶系

2.1 淀粉酶類及功能

在醬香型白酒發(fā)酵過程中，大曲作為重要的復(fù)合酶制劑，參與谷物原料中淀粉降解為糊精，進(jìn)而產(chǎn)生酒精，其中淀粉酶作為降解淀粉的“主力軍”。糖化型淀粉酶能夠降解谷物原料中淀粉的α-1,4 型和α-1,6 型糖苷鍵，生成葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖等可發(fā)酵性糖[35]，由于淀粉酶種類較多，根據(jù)淀粉酶水解淀粉作用的糖苷鍵位置和反應(yīng)的端基基團(tuán)的不同，可分為α-淀粉酶、β-淀粉酶、γ-淀粉酶等，白酒發(fā)酵過程中以α-淀粉酶為主[36]。通常條件，因作用溫度的不同，α-淀粉酶可分為低溫α-淀粉酶、中溫α-淀粉酶和耐高溫α-淀粉酶，作用條件為40～70 ℃、pH 6.0～7.0。研究表明，合理控制淀粉酶含量可以提高發(fā)酵糖的生產(chǎn)速率，有效調(diào)控白酒中高級醇的含量，提高白酒出酒率[37]。宗緒巖等[38]通過模擬白酒固態(tài)發(fā)酵的方式，添加活性干酵母0.8 %、糖化酶1000 U/g、α-淀粉酶50 U/g 時，高級醇總量比空白降低了21.06 %，合理調(diào)控了高級醇的含量，提高白酒的品質(zhì)。

2.2 蛋白酶類及功能

蛋白酶類是機(jī)體內(nèi)能夠有效水解蛋白質(zhì)肽鍵的一類酶系總稱，能夠有效的分解機(jī)體內(nèi)蛋白質(zhì)產(chǎn)生相應(yīng)的營養(yǎng)物質(zhì)。根據(jù)反應(yīng)最適pH 值，可分為酸性蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶。研究表明，在酒曲發(fā)酵過程中，一方面，曲塊會生酸，故酸性蛋白酶在白酒發(fā)酵過程中作用較大，其作用條件為40 ℃、pH2.5～4.0；另一方面，蛋白酶與白酒風(fēng)味物質(zhì)的形成有密切的聯(lián)系，其中主要是蛋白質(zhì)的降解物氨基酸決定很多白酒風(fēng)味物質(zhì)[39-40]。孫金旭等[41]通過單因素試驗(yàn)探究蛋白酶對醬香型白酒發(fā)酵過程中異戊醇（雜油醇）生成的影響，結(jié)果表明，當(dāng)?shù)鞍酌柑砑恿繛?0 U/g 時，白酒中異戊醇含量降低89.80 %，說明蛋白酶是醬香型白酒中異戊醇生成的主要影響因素，合理控制蛋白酶含量可以有效控制白酒酒體的異常。CATARINA 等[42]通過向含氮量較低的發(fā)酵體系中加入磷酸氫二銨或氨基酸類物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，異戊醇的合成會因?yàn)榭偟康脑黾佣黠@降低，但是正辛醇的含量卻有所降低。此外，在醬香型白酒釀造過程中，高溫大曲質(zhì)量的差異會影響白酒的酒質(zhì)和口感，篩選優(yōu)質(zhì)的高溫大曲的主要標(biāo)志是蛋白水解酶的活性，一定條件下，蛋白酶的酶解反應(yīng)和還原糖作用生成高含量、多種類的化合物，保證曲香濃郁、優(yōu)雅純正[43]。

2.3 糖化酶類及功能

糖化酶又稱葡萄糖淀粉酶，其功能是水解淀粉中的α-1,4型和α-1,6型糖苷鍵，有效的將淀粉轉(zhuǎn)化為葡萄糖，進(jìn)而生成乙醇。糖化酶活性與淀粉利用率成正比，糖化酶活性越高，淀粉利用率則越高。通常，糖化酶的最適反應(yīng)條件為pH4.0～4.5，但當(dāng)pH 值低于2.5 時，糖化酶也會保持一定酶活性，所以糖化酶適宜在白酒發(fā)酵過程中酸度不斷增加的情況[44]。魯珍等[45]對前期高溫大曲中8 株產(chǎn)醬香菌株進(jìn)行產(chǎn)糖化酶篩選，通過形態(tài)觀察及16S rDNA序列同源性分析，得到名為Bacillus cereus的產(chǎn)糖化酶能力最強(qiáng)菌株，然后進(jìn)行單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化后，其產(chǎn)物糖化酶活力高達(dá)917.03 U/g；周天銀等[46]通過添加糖化酶的方式，使成品酒中的雜醇油的含量全部有效的控制在0.18 g/100 mL以內(nèi)，同時提高出酒率0.96 %。趙金松等[47]在小曲白酒發(fā)酵的傳統(tǒng)工藝中加入了適量糖化酶，代替小曲作為糖化發(fā)酵劑，結(jié)果表明，糖化酶不僅提高原料的淀粉利用率，也使淀粉的糖化進(jìn)行得更加徹底，提高了原料的出酒率。

2.4 纖維素酶類及功能

纖維素酶是指可以有效的水解β-1,4 型糖苷鍵成為纖維二糖和葡萄糖的一類酶系的總稱，通常是由內(nèi)切葡萄糖苷酶（EG）、纖維二糖水解酶（CBH）和β-葡萄糖苷酶（BG）共同組成。纖維素酶可以將原料中的淀粉、纖維素和半纖維素轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵性糖，進(jìn)而經(jīng)酵母協(xié)同轉(zhuǎn)化為酒精，提高出酒率。研究表明，纖維素酶的添加可以有效的提高白酒酒體質(zhì)量和酒糟利用率。李旭暉等[48]研究固態(tài)發(fā)酵工藝中纖維素酶對大曲酒中醇、醛、酸、酯等風(fēng)味物質(zhì)的影響發(fā)現(xiàn)，當(dāng)纖維素酶添加量為10 FPU/kg時，所產(chǎn)酒中醛類及雜醇油等含量降低，而四大酯及對應(yīng)酸含量升高；當(dāng)纖維素酶添加量為30～50 FPU/kg時，所產(chǎn)酒口感良好、風(fēng)格突出；楊建梅等[49]通過甲基磺酸乙酯（EMS）連續(xù)誘變后，獲得從大曲中篩選出1 株高產(chǎn)纖維素酶誘變菌株RY49，利用RY49 制備出功能性纖維素酶簾子曲，并應(yīng)用到白酒丟糟中，其出酒率（60 %vol 糟酒/100 kg 丟糟）達(dá)到了3.89%，有效提升了丟糟的經(jīng)濟(jì)價值。

3 結(jié)論和展望

隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，白酒香型的研究廣為延伸，有關(guān)大曲微生物及其酶系的研究也越來越深入，大量科研工作者們對酒曲中細(xì)菌、霉菌和酵母等研究，揭開了白酒釀造過程的神秘面紗。大曲中微生物是決定白酒香型特點(diǎn)的主力軍，白酒發(fā)酵又是多種微生物菌系及酶系共同作用的結(jié)果。目前，對于醬香大曲中微生物和白酒發(fā)酵酶系呈系統(tǒng)化深入認(rèn)識比較少，后續(xù)有待于系統(tǒng)化揭秘白酒固態(tài)發(fā)酵機(jī)理。此外，保證白酒發(fā)酵過程中菌系、酶系及物系的相互作用，用于提高和突出白酒酒體質(zhì)量和風(fēng)格是廣大白酒科研工作者們共同努力的目標(biāo)。