板栗葉焦枯病相關病菌分離及病因初探

任 菲，董 煒，史勝青，汪慧華，竇桂銘，嚴東輝＊

(1. 中國林業科學研宄院森林生態環境與保護研究所國家林業和草原局森林保護重點實驗室，北京 100091；2. 國家糧食和物資儲備局科學研究院糧油加工研究所，北京 100037；3. 中國電力科學研究院，北京 100192；4. 中國林業科學研究院林業研究所，北京 100091；5. 北京農業職業學院食品與生物工程系，北京 100085)

焦枯病是近年來樹木或植物常見的一類葉部病害。其病因復雜，多由不適環境因素引起，如營養元素過量和鉀元素缺乏、干旱脅迫、高溫日曬等，造成植物水分生理失調，導致葉組織大面積產生枯斑，引發葉焦枯[1-2]。隨著氣候變暖和環境變化，病原菌導致植物葉焦枯病的種類增多，如由侵染性病原菌真菌擬莖點霉Phomopsis mollissim與其共生菌板栗蛇孢日規殼Ophiognomonia castaneae引起的板栗褐緣葉枯病[3-4]；通過昆蟲媒介傳播的植物病原細菌木質部難養菌Xylella fastidiosa導致的葉焦枯病也日益頻發。該細菌病原菌營養需求復雜、寄主范圍很廣，在多種重要的林木、觀賞性植物及農業經濟作物形成嚴重危害，已經成為全球性日益關注的新發流行病害[5-6]。

中國板栗（Castanea mollissimaBl.) 屬于殼斗科栗屬的植物，原產于中國，有“干果之王”之稱[7-8]，河北板栗主要產于河北省北部的燕山山區，以顆粒飽滿、香甜、皮薄、適于糖炒等特點著稱于世，久負盛譽，是河北省出口農副產品中具有較大優勢的土特產品之一，其產量、出口量和質量，均居全國第一位[8-9]。并且，板栗栽種面積占到全省有林地的10%，成為河北省重要的經濟和生態樹種[10]。近些年，青龍、遷西等板栗主產地相繼發生一種新的葉部病害，板栗發病后，葉片上產生黃褐色的斑點，多個黃褐斑可滲透連片，以致使整個葉片上呈不規則的大面積焦枯狀，引起果實重量減少，產量下降，造成栗農經濟損失，該病害發病原因亟待明確，盡早進行有效的防控。

1 研究材料和方法

1.1 標本采集及病征觀察

標本于2019 年7 月至9 月，采于河北青龍縣和遷西縣(40.40° N, 118.95° E)5 個病害發生嚴重的板栗果園，果園相距5～70 km。在栗園，觀察癥狀的同時，放大鏡鏡檢病癥；在實驗室，解剖鏡鏡檢病組織表面病癥，及顯微鏡鏡檢病組織真菌分生孢子器和子實體或細菌霧；實驗室新鮮離體病葉組織濕培25℃，每天觀察病癥至第7 天。

1.2 病原菌分離

病原菌的分離和純化采用組織分離法[11]，將新鮮的病葉用清水沖洗干凈，用75% 乙醇表面消毒，從其病健交界處用滅菌手術刀切取3～5 mm,置于PDA 培養基、MEA 培養基和細菌蛋白胨培養基上25℃恒溫培養，待菌絲或菌落長出后，進行轉接純化，并在PDA 培養基上于25℃恒溫培養，菌絲長滿后，置于4℃冰箱中保存備用。每戶葉片組織接種12 個平板，每個PDA 平板接3 塊組織。

1.3 分離純化菌株的分子鑒定

分離菌株按形態初步歸類后，用CTAB 法提取和純化菌株的基因組DNA[12]，用通用引物ITS1 和ITS4 進行ITS rDNA 基因片段的擴增，PCR 產物經回收純化后，由北京六合華大基因有限公司進行測序。所得序列經NCBI 進行堿基Blast 同源性分析，確定菌株分類地位。利用Mega X 構建系統發育樹，建樹方法最大簡約法（Maximum parsimony，MP），可靠性檢驗bootstrap法，初始值1 000 次，外群為Acervus globulosusHKAS 88987，系統發育樹中本研究測得的序列號為MT373425-MT373459，Genbank 中下載用于比對分析做系統發育樹的序列見表1。

表1 Genbank 中下載用于比對分析做系統發育樹的參考序列Table 1 Sequences from Genbank for alignment and phylogenetic tree

1.4 潛在病原菌離體葉片及板栗盆栽苗接種

依據1.3 的結果，結合已報道致病性的菌株進行接種試驗。室內離體接種選取健康無病的新鮮葉片，葉片采自溫室1 年健康苗的成熟葉片（停止伸展發育后20～30 天），用清水沖洗干凈，75% 乙醇消毒5 min，再用無菌水沖洗多次，置于事先滅菌的培養皿（直徑150 mm，底部墊2～3 層無菌濾紙，并加入適量無菌水保濕）中。因為發現在培養觀察期間，分離菌株培養有產孢和不產孢，因此，接種體前者用分生孢子，后者用菌絲（菌餅）。將PDA 平板上培養5～7 天的分離物，無菌水沖洗孢子，制成106孢子·mL-1接種液；或用直徑5 mm的打孔器在菌落邊緣取菌餅。預實驗發現無傷接種不成功，因此，用刺傷進行接種（用消毒昆蟲針在健康葉片表面針刺后，將菌餅貼接于刺傷部位）。每處理接種5 個葉片，每片葉接3 個點，另以葉片相同部位接種無菌水處理為對照。接種封好后置于25℃培養箱黑暗培養。接種48 h 后移去菌絲塊，隔天觀察發病情況并記錄兩周。

根據離體葉片接種結果，選取病原菌進行1 年生盆栽苗接種實驗，將菌絲塊接種盆栽苗板栗葉片上，每種致病菌株接種3 盆苗木，每苗木處理5 個葉片，并用無菌水同時接種等數量的盆栽板栗苗作為對照，保鮮袋保濕24～48 h 后去掉，定期觀察發病情況。發病后取具有癥狀的組織再次進行病原菌分離。

2 結果與分析

2.1 栗園病害癥狀

病害在河北板栗園6 月開始發病，病樹整樹葉片均出現癥狀，發病樹木相對集中（圖1a），果園樹病率10%～50%，單株病葉率可至100%。該病害主要癥狀是，初始在葉片銳齒尖現褐色小點壞死（圖1b），隨著時間，順沿葉緣至兩側脈之間的葉間組織呈現黃褐色至黑褐色病斑，病斑形狀不規則，邊緣不整齊，大小為2～3 cm，每葉片上能產生多個病斑（圖1c），多個黃褐斑可滲透連片，以致使整個葉片上呈不規則的大面積焦枯狀，均出現在葉脈間的葉組織上，病斑病健部有不規則寬度的亮黃色邊緣線（圖1d）。但病害不造成早期落葉。林間病葉未見病癥。室內顯微鏡觀察，也未見顯著真菌分生孢子器和子實體。室內病組織保濕培養3 天后，可鏡檢到鏈隔孢屬Alternaria的分生孢子。栗園發病癥狀如圖1。

2.2 病葉菌株分離純化鑒定

栗園及室內在新鮮癥狀組織上均沒有觀察或鏡檢到病癥，濕培3 天后的病組織表面上可見有分散的較暗的細點，鏡檢確認是鏈隔孢屬Alternaria的產孢梗及其分生孢子，極易被從病組織表面抹去。顯微鏡鏡檢也沒有發現病健交界組織中的細菌菌溢現象。

圖1 河北板栗葉片焦枯病癥狀Fig. 1 leaf scorch ofCastanea mollissima in Hebei

表2 河北板栗焦枯葉真菌菌株分離結果Table 2 Fungi isolation from leaf scorch samples

病葉組織分離純化共獲得有效菌株102 株，均為真菌。在菌落形態聚類的基礎上，選取菌株擴增ITS。結果這些真菌歸屬于10 科，12 屬，15種，豐度最高為Alternaria alternata（表2）。分離菌株的系統發育樹見圖2。分離菌株的主要培養物形態見圖3。

圖2 分離菌株系統發育MP 樹Fig. 2 Phylogenetic tree (MP) of Isolation

2.3 潛在病原菌離體葉片及板栗盆栽苗接種實驗

依據文獻報道，重點挑選分離菌株中潛在的致病菌進行板栗離體葉片接種實驗。選出8 個菌：半殼霉屬Leptostromasp.，蛇孢日規殼Ophiognomoniasetacea(Pers.) Sogonov， 梨 盾 殼 霉Coniothyrium pyrinum(Sacc.) J. Sheld.， 稻 黑 孢 菌Nigrospora oryzae(Berk. & Broome) Petch， 擬 莖 點 霉屬Phomopsissp. ， 膠 孢 炭 疽 菌Colletotrichum gloeosporioides(Penz.) Penz. & Sacc.，Gnomoniopsis smithogilvyiL.A. Shuttlew., E.C.Y. Liew & D.I.Guest，交鏈鏈格孢Alternaria alternata(Fr.) Keissl.。只有其中O. setacea和C. pyrinum兩種菌接種的實驗葉片出現了病斑，4～5 天出現癥狀，一周后病斑基本穩定，不再變化，病斑位置局限于接種點附近（圖4）。記號筆標出了接種部位，而其他幾組菌種實驗連續觀察后均未出現明顯病斑癥狀。另外我們還嘗試混合了8 種菌絲液，并混合Ophiognomonia setacea和Phomopsissp.菌絲液進行板栗離體葉片接種實驗，但并未出現明顯癥狀。

圖3 主要菌株培養物Fig. 3 Culture of main isolates

圖4 板栗離體葉片接種實驗癥狀Fig. 4 Symtoms of inoculation of isolated leaves indoor of Castanea mollissima

在O. setacea和C. pyrinum離體葉片致病的基礎上，進一步進行了兩種菌株的1 年生板栗盆栽苗致病實驗。結果O. setacea和C. pyrinum兩種菌均引起盆栽苗成熟葉片的病變，出現褐色壞死病斑。病斑接種后一周左右出現，大小不定，形狀不規則，10～14 天后病斑停止擴展趨于穩定（圖5）。從發病部位可再次分離到這兩種病原菌。

圖5 板栗盆栽苗接種實驗癥狀Fig. 5 Symtoms of inoculation of Potted seedlings of Castanea mollissima

3 討論

3.1 板栗焦枯病病因分析

河北地區發生的栗葉焦枯病害主要癥狀是，初始葉緣刺突現褐色小點壞死，隨后，順沿葉緣至兩側脈之間的葉間組織呈現黃褐色至黑褐色不規則病斑，可擴展連片，呈不規則的大面積焦枯，葉脈附近組織無癥狀，病健部有不規則寬度的亮黃色邊緣線。病樹在栗園可集中成片發生，病樹之間受害程度較為一致，單株病樹的病葉之間及栗園病樹間癥狀不呈現點狀擴散分布趨勢特征，病樹發病葉片幾乎遍布整株，病葉之間癥狀極為一致。同一栗園同一樹木可連年發病，程度年間呈現變化。不同立地或地塊栗園和不同栗樹間均可發病，程度上可有差異。初步比較觀察，病樹的根部與健康樹的根部沒有明顯病變和異常氣味；病葉枝條（2～3 年生）橫切面觀察，未見到維管束褐變。我國板栗病害，姜淑霞等[13]曾報道了山東地區板栗褐緣葉枯病，稱病害突出特點為病斑壞死組織擴散十分快，整葉出現焦枯，葉片脫落嚴重。葉片脫落后正面產生少量散生子實體，顯微鏡下分生孢子器散生，病原菌為Phomopsis mollissimae。另外報道有板栗黑（圓）斑病，病斑近圓形，有黃色暈圈，其病原為Cylindrosporium castanicola[14-15]；病菌Phomopsis castanea亦引起的葉斑病，表現為葉片大面積干枯[16]，但該病癥狀只有文字描述，沒有栗園和病樹圖像記錄。以上癥狀描述與本病害均存在不一致性，并且具有病癥，而本病害在栗園、室內濕培以及鏡檢均未見到病癥以及特定真菌結構。雖然通過組織分離法，分離到很多真菌，但室內離體葉片實驗和板栗盆栽苗接種實驗，只有菌株O. setacea和C. pyrinum，能在成熟葉片上引起局限性的褐變病變，但均與林間焦枯病癥狀不一致。細菌Xylella fastidiosa.在歐美報道能引起嚴重的多種寄主葉焦枯病[5]，但未見到在栗屬植物上的為害報道。該病具有依賴昆蟲傳播的特點，病斑具有侵染點且具有明顯的病斑發生發展特征，這與我們觀察到的板栗葉焦枯病病斑發病特點明顯不同，板栗葉焦枯病發病初期和期間，病斑一出現即為較大面積的壞死病斑，病斑沒有侵染起始點、沒有從侵染點發展至病健部的病斑發生發展過程特征。難以培養的病原細菌，通常需要昆蟲媒介的傳播，但本病未觀察到刺吸式昆蟲的伴隨或為害。病組織常規鏡檢未觀察到菌溢現象。因此，本病的生物致病侵染屬性還有待進一步的探究。

然而，隨著氣候變暖和環境污染增加，樹木葉焦枯病癥狀類病害頻現，這類病害更多的是環境中不利于植物生長發育的物理和化學等非生物因素引起的非侵染性焦枯病[17]。肥、水、土壤、氣候及耕作制度等環境條件與該病發生關系十分密切，其中尤以干旱、高溫日灼、營養不足為主導因素。SO2是我國主要大氣污染物之一，其危害從植物氣孔周圍細胞開始，初期斑點與氣孔形狀相似，后期針葉全葉枯死，闊葉發展為淡褐色或灰白色壞死斑，葉果早落[17]。而臭氧主要侵染葉片柵欄組織，葉面出現白色或褐色斑點，對針葉樹，癥狀多出現在成熟葉，對闊葉樹，癥狀首先出現在抽生枝條的近頂端葉片[17]。曹淑云[1]發現當板栗葉片硼過量（含量超過400 mg·kg-1）時即發生焦枯癥狀；當板栗葉片缺鉀（含量低于4 000 mg·kg-1）時即表現焦枯癥狀。但在本研究調查過程中，針對焦枯病，栗農嘗試過包括微量元素全肥在內的多種增加相關肥料的措施，對改善癥狀減輕程度表述不一。近些年為追求板栗產量，栗農采用了大肥大水的管理措施，尤其是為便利收果，在栗園頻繁使用農藥和除草劑。這些不合理的栗園管理措施，可能是板栗葉焦枯病發生的主要誘因。另外，葉焦枯病的發生可能與板栗品種有關，發病品種主要為燕山早豐3113品種。該品種由河北省昌黎果樹研究所于1973年，在楊家峪1.7 萬株板栗實生樹中選出推廣，其板栗優質性狀改善了板栗品種的局面，對產區的板栗增產起到了重要作用，在河北地區廣泛種植[18]。近些年，在全球氣候變化的大環境下和進一步提升板栗產值的農事管理活動中，品種頻現一些適應性和抗病性問題。因此，綜合現場調查和研究結果，我們認為河北近年大面積發生的板栗葉焦枯病的病因，需要擴展考慮非侵染因素誘導的問題。該病亟待綜合病原菌、土壤水分利用、農藥、復合肥、除草劑、氣候條件、管理措施等所有相關因素的綜合考察和研究探明病因，為及早防控病害帶來的經濟損失提供科學依據。

3.2 分離菌株致病性

本研究新發現并驗證了O.setacea和C. pyrinum兩種病原菌可在中國板栗葉片上致病。O.setacea與板栗蛇孢日規殼O.castaneae同屬，后者為山東地區板栗褐緣葉枯病原菌板栗擬莖點霉Phomopsis castaneae-mollissimae協同致病菌[19]。除O.castaneae外，該屬僅有O.apiospora和O.asiatica在我國赤楊和櫟屬上報道過有分布[19-20]。O.setacea主要在歐美國家報道，與該屬其他成員相比寄主范圍相對更廣泛一些[21-22]，在中國板栗上未有過報道。在實驗室本菌PDA 培養基培養7 天的菌落特征為近圓形，直徑約5 cm，邊沿起伏，淺黃綠粉質，具環狀同心輪紋，培養觀察期間未見產孢（圖6a）。分子鑒定中，菌株ITS rDNA 序列與O. setacea模式種的序列相似性97%，我們將其暫定為此種。

圖6 Ophiognomonia setacea 和Coniothyrium pyrinum 培養物Fig. 6 Culture of Ophiognomonia setacea and Coniothyrium pyrinum.

C. pyrinum主要在蘋果葉片形成葉斑，葉斑大小形狀顏色各異，斑點嚴重的葉片變黃早落，一般發生在仲夏雨季[23]。其還可以引起杏樹嚴重的枯死和潰瘍病[24]。該菌在板栗上可以引起病害為首次發現。病菌培養性狀如圖6b。PDA 上7 天的菌落近圓形，直徑約4.5 cm，邊緣光滑，菌落棕黃色，產有淺黃色素滲入培養基并彌散于整個培養基中，培養期間未觀察到子實體形成。該菌ITS 序列與C.pyrinum模式菌株高度同源，覆蓋率100%下，相似性達99%。

另外我們分離到的其他一些未表現致病性的菌株，在栗屬（CastaneaMill.）其他植物上有相應致病性報道。如分離到的兩株Gnomoniopsis smithogilvyi被報道能在歐洲板栗（Castanea sativaMill.）上引起嚴重的潰瘍癥[25]及果腐病[26-27]。在全球氣候變化等因素影響下，病原菌寄主范圍擴大現象日益普遍，此類病原菌存在成為板栗新發病害的可能性，應予以重視。

4 結論

初步研究結果表明，青龍和遷西板栗果園嚴重發生的葉焦枯病中，未能明確為上述相關病原菌所引起。其病因有待進一步的綜合、深入和細致地開展研究，尤其需要考慮與為追求產量，高投入的不合理水、肥和農藥使用等栗園管理措施以及環境因素和品種適應性等相關性的可能。研究中，發現并驗證的O. setacea和C. pyrinum兩種病原菌可在中國板栗上致病，為板栗可能出現的新病害的發生和認識提供了基礎。