水淹持續脅迫對濕地松光合特性及生理生化的影響

郭 燕，沈雅飛,2，程瑞梅,2＊，肖文發,2，楊 邵，王麗君

(1. 中國林業科學研究院森林生態環境與保護研究所，國家林業和草原局森林生態環境重點實驗室，北京 100091；2. 南京林業大學，南方現代林業協同創新中心，江蘇 南京 210037)

三峽大壩于2009 年竣工，旨在控制洪水、方便航行、供水和發電[1-2]。根據大壩“蓄水清排濁”方案，其6－9 月為低水位運行期（壩前145 m 高程低水位為下限）；9 月至來年5 月為高水位運行期，期間整個消落帶被全部淹沒（壩前175 m 高程征地線為上限）。因此，與我國自然河岸帶的“夏季淹沒、冬季干旱”特征不同，三峽水庫消落帶具有“夏季干旱、冬季淹沒”的特點[3]。目前，在三峽水位正常運行下，三峽庫區消落帶已經歷了很長時間的反季節性的“水淹-干旱-水淹”的影響，這是干擾河岸帶植物生長的主要因素。消落帶植被所面臨的水文狀況復雜，其夏季受干旱脅迫時長超過1 個月，同時，植物在經歷夏季很長時間的干旱脅迫后，就會面對接踵而至的長達5 個月的水淹脅迫，這在一定程度上為植被恢復篩選適生物種帶來了更加嚴峻的挑戰。自蓄水以后，由于植物對非季節性水淹逆境的不適應性，目前已導致三峽庫區消落帶植被出現嚴重退化現象，這直接干擾了河岸生境的結構和功能；同時，三峽庫區消落帶屬于“自然-經濟-社會”的復合系統，對外界干擾非常敏感，目前除面臨嚴峻的生態環境問題外，還面臨流行性疫情多發等經濟社會問題。有研究指出，三峽庫區秭歸段消落帶受反季節運行模式影響，其冬季淹水、夏季干旱的特殊干濕交替生境使不同土層土壤的酸堿度、淋溶程度、可揮發硫化物等理化性質和環境參數產生變異，從而影響了土壤中各類型重金屬的遷移轉化規律，通過污染評價可得其所在消落帶土壤大多受重金屬鐵、錳復合型污染[4]。

濕地松（Pinus elliottiiEngelmann）是松科松屬的一種常綠喬木，原產地樹高達30 m，胸徑90 cm；樹皮灰褐色或暗紅褐色；枝條生長3～4 輪·a-1；針葉深綠色，2～3 針一束并存，有氣孔線；球果窄卵圓形或圓錐形；種子卵圓形，種翅易脫落；常適生于低山丘陵地帶，耐水濕，生長勢常比同地區的馬尾松（P. massonianaLambert）或黑松（P.thunbergiiParlatore）好，很少受松毛蟲危害；對氣溫適應性較強，能忍耐40℃的絕對高溫和-20℃的絕對低溫；在中性以至強酸性紅壤丘陵地以及表土50～60 cm 以下鐵結核層和沙黏土地均生長良好，而在低洼沼澤地邊緣尤佳，但也較耐旱，在干旱貧瘠低山丘陵能旺盛生長；抗風力強，其根系可耐海水灌溉，但針葉不能抗鹽分的侵染，為最喜光樹種，極不耐陰，分布極廣泛；在中國北緯32°以南的平原，向陽低山均可栽培，可作為經濟樹種，也可作為風景園林和水土保持林[5]。目前，國內外對濕地松展開了包括生物學特征、光合特性、施肥狀態下的生長反應等相關研究[6-11]。三峽水庫水位運營特性使消落帶周期性處于“干旱-水淹交替”的生境，為探索三峽水庫消落帶實際“干旱-水淹交替”生境下濕地松的耐受性能，揭示其變化規律，本研究以2 年生適生植物濕地松為研究對象，通過模擬消落帶“夏季干旱-冬季淹水”的實際生境環境，研究在特定生境條件下濕地松的光合性能及生理生化特性的變化規律，探索前期干旱脅迫是否會增加植物對后期水淹脅迫的敏感性等科學問題，為三峽水庫消落帶植被恢復奠定基礎。

1 研究區域自然概況

本研究區域位于湖北省秭歸縣茅坪鎮，緊鄰三峽庫區(30°38′14″～31°11′31″ N，110°00′04″～110°18′41″ E)，屬亞熱帶大陸性季風氣候區，氣候溫暖濕潤，四季分明；地質巖層以花崗巖為主，研究區域土壤類型以黃壤土和黃棕壤為主，土壤厚度約40 cm?！?10℃積溫5 723.6℃，年均氣溫19.0℃。年均降水量1 100.0 mm，年均相對濕度78%。

圖1 三峽庫區消落帶位置示意圖Fig. 1 Diagram of the location of the Hydro-Fluctuation Belt in the TGRA

2 研究方法

2.1 試驗材料及試驗設計

試驗在湖北秭歸長江三峽庫區森林生態系統國家定位觀測研究站進行（30°53′ N, 110°54′ E, 海拔296 m，圖1）。2017 年6 月初，將從湖北荊門彭場林場購買的生長基本一致的濕地松幼苗統一栽入塑料花盆中（直徑32 cm，高22 cm），每盆1 株（栽種土壤為5.0 kg當地沙壤土），將2 年生濕地松盆栽植株放入搭建好的遮陽棚中緩苗，恢復生長后將其放置在選定空地上進行相同光照和水分管理，并提前半個月使各處理組達到所設定干旱狀態。2017 年8 月初進行前期干旱模擬，采取單因素隨機區組設計。試驗模擬三峽水庫當年8 月至次年5 月消落帶水位波動的消漲規律。前期45 d 模擬干旱脅迫組設置為：（1）對照組（CK），正常水分灌溉（一般保持田間持水量的60%～63%，質量法）；（2）輕度干旱組（T1），每5 d 澆水1 次；（3）中度干旱組（T2），每10 d 澆水1 次。待干旱脅迫試驗結束后，供試濕地松幼苗恢復正常生長后，進行5 個月的冬季淹水脅迫試驗。具體操作如下：將供試幼苗統一放置在一個水池中（分3 個小方形，一側長2.5 m，深度分別為1.8、0.8、0.5 m）。冬季淹水脅迫試驗設置為：（1）對照組（CK），非淹水處理，同上；（2）根淹組1（原輕度干旱組）、根淹組3（原中度干旱組），淹水至土壤表面以上約5 cm 處；（3）全淹組2（原輕度干旱組）、全淹組4（原中度干旱組），淹水至植物上方5 cm 處。冬季淹水脅迫試驗期間，水池每隔1 周換1 次水，氣溫為5～27℃，相對濕度為54%～82%。從試驗處理之日起，選取中上部枝條頂端向下3～4 cm 以下生長健壯的成熟功能針葉，分別于第0、7、15、30、45、60、120、150 d 進行光合及生理生化指標測定，其中，在測定全淹組植株葉片前，均將植株提前移出水面并用紙巾或者棉布擦干，選取原則與其他組保持一致。

2.2 試驗指標測定

2.2.1 光合指標的測定 在晴朗天氣的上午9：00－11：30 進行測定[5]。選取植株完好的健康成熟功能葉，利用光合儀（Li-6 400 XT 便攜式光合測定儀2×3 紅藍光源葉室），在飽和光強下完成光誘導，穩定后測定針葉內氣體交換參數，包括光合速率（Pn）、氣孔導度（Gs）、胞間CO2濃度（Ci）和蒸騰速率（Tr），每組測定3 株，每株測定3 次，取平均值[12]。測定時設定光合有效輻射為1 000 μmol·m-2·s-1，相對濕度為60%～70%，葉室溫度為20℃，CO2用提前制作好的大塑料瓶吸收3 m 高空穩定的CO2濃度，濃度為400～410 μmol·mol-1[12]。

2.2.2 生理生化指標的測定 試驗中，樣品膜質過氧化物及超氧化物歧化酶（SOD）等粗酶液的提取參照 Grace 等的方法，稍作修改后測定[13-14]?？扇苄缘鞍缀坎捎每捡R斯亮藍 G-250 染色法測定[13]。SOD 活性采用NBT 法（氮藍四唑比色法），稍作修改后測定[13]；過氧化氫酶（CAT） 活性采用紅外分光光度計法測定[13]；過氧化物酶（POD） 活性采用愈創木酚法測定[13]；丙二醛（MDA） 含量測定采用硫代巴比妥酸法測定[13]。

2.3 數據處理與分析

采用Microsoft Excel 2016 和SPSS17.0 軟件進行數據統計分析。使用one-way ANOVA 來揭示持續水淹程度對濕地松幼苗光合及生理生化的影響，并運用Turkey 檢驗法進行多重比較。運用繪圖軟件Origin 8.6 制圖。

3 結果與分析

3.1 濕地松幼苗光合指標的變化

圖2 表明：水淹脅迫能顯著影響濕地松幼苗的凈光合速率（Pn）、氣孔導度（Gs）、胞間CO2濃度（Ci）和蒸騰速率（Tr）。經方差分析發現，隨著水淹程度的增加，濕地松光合氣體交換的生理響應特性在不同水淹處理組之間的表現各異（圖2A～D）。隨水淹時間的增加，根淹組1、全淹組2 和根淹組3、全淹組4 處理組Pn逐漸下降；至水淹結束，根淹組1、全淹組2、根淹組3 和全淹組4 的Pn與初始值相比，分別下降30.9%、33.0%、51.9%、62.3%（圖2A）。

不同水淹脅迫組的Gs隨時間的變化與Pn基本一致，全淹組（2、4 組）植株的Gs自水淹15 d 后明顯低于對照植株，且隨著水淹時間的增加，Gs逐漸降低；而根淹組（1、3 組）植株的Gs直到脅迫時間達到30 d 后才明顯低于對照組。至水淹脅迫結束，全淹組4、根淹組3、全淹組2、根淹組1 的Gs分別比對照植株降低了55.7%、44.2%和64.3%、44.4%（圖2B）。

由圖2C 可知：水淹脅迫嚴重影響了濕地松針葉的Ci，從水淹脅迫開始，濕地松針葉的Ci隨著水淹時間的增加逐漸降低；在水淹脅迫達到45 d前，不同淹水組Ci變化不大；但水淹45 d 后，不同淹水組的Ci表現為根淹組1 ＞ 全淹組2 ＞ 根淹組3 ＞ 全淹組4。

在水淹脅迫45 d 時，根淹組1、全淹組2 和根淹組3 幼苗的Tr均受水淹脅迫影響差異不大，但隨水淹脅迫時間的延長，根淹組3 和全淹組4 植株的Tr出現了大幅下降，至水淹150 d時，根淹組3和全淹組4 植株的Tr比對照植株分別降低了65.5%和74.0%，而根淹組1 在整個水淹脅迫過程中Tr均維持在正常水平；全淹組2 植株的Tr比對照植株的降低了39.5%（圖2D）。

3.2 濕地松幼苗生理生化指標的變化

由圖3A 可知：水淹處理初期，濕地松針葉內的蛋白質含量呈波動上升趨勢，但隨水淹時間的增加而下降；至水淹處理60 d 時，除根淹組1 外，其他處理組的蛋白質含量均達到最大值，與初始值相比分別增加了14.7%、66.2%、32.5%、18.9%；至水淹結束，不同淹水處理組中蛋白質含量下降，大小表現為：全淹組4 ＞ 全淹組2 ＞ 根淹組3 ＞ 根淹組1。

不同水淹處理7 ～15 d 時，根淹組1、根淹組3 和全淹組2 濕地松幼苗針葉中的SOD 活性變化較大，全淹組4 的SOD 活性變化較穩定；水淹30 d時，根淹組1、3 的SOD 活性達到最高，分別為915.21、924.73 μmol·g-1，而全淹組4 的SOD 活性最低，為592.53 μmol·g-1（圖3B）。

圖2 不同淹水條件下濕地松的凈光合速率（Pn）、氣孔導度（Gs）、胞間CO2 濃度（Ci）和蒸騰速率（Tr）隨時間的變化Fig. 2 Time-dependent changes of Pn, Gs, Ci and Tr of Pinus elliottii under different flooding conditions

圖3 不同淹水條件下濕地松的蛋白質含量、SOD、POD、CAT 和MDA 隨時間的變化Fig. 3 Changes of protein content, SOD, POD, CAT and MDA with time under different flooding conditions in Pinus elliottii

水淹前，對照組的POD 活性明顯高于其他處理組，但隨著水淹時間的增加，各處理組針葉中的POD 活性變化差異不大；在水淹脅迫30 d時，根淹組1、全淹組2、根淹組3 和全淹組4 的POD 活性均達到最低，分別為58.679、55.606、64.681、27.784 μmol·g-1。除對照組外，對于同一處理，隨水淹時間的增加，POD 活性呈先降低后增加的趨勢（圖3C）。

不同水淹下，在經歷不同脅迫時間后，濕地松針葉中的CAT 活性差異不明顯；在水淹脅迫45 d后，根淹組3 和全淹組4 的CAT 活性與對照組相比差異顯著；隨著水淹時間的增加，水淹組的CAT 活性均呈現出增加后逐漸穩定的趨勢。試驗結束后，根淹組1、全淹組2、根淹組3、全淹組4 的CAT 活性相比初始值分別增大了59.1%、56.1%、69.4%、90.1%（圖3D）。

不同水淹處理組濕地松幼苗在7、15 、30 d 時的MDA 含量變化均差異不明顯；隨著水淹時間的增加，至水淹45 d 時，MDA 含量變化規律為根淹組3 ＞ 全淹組4 ＞ 全淹組2 ＞ 根淹組1 ＞ 對照組。在前期輕度干旱下，根淹組1 和全淹組2 植株在水淹45 d 前并沒有明顯變化，但在水淹45 d 后，全淹組2 與根淹組1 的MDA 含量差異顯著（P＜ 0.05）；在前期中度干旱下，根淹組3 和全淹組4 植株在水淹45 d 前變化不明顯，但在水淹45 d 后，根淹組的MDA 含量明顯高于全淹組含量。隨著水淹時間的增加，對照組濕地松針葉中的MDA 含量呈先降低后逐漸增大至最初水平；根淹組1、全淹組2、根淹組3 和全淹組4 針葉中的MDA 含量分別在水淹120、150、60、45 d 達到最大值，分別為1.346、1.461、1.591、1.366 μmol·g-1（圖3E）。

4 討論

4.1 冬季水淹脅迫對濕地松光合指標的影響

不同水淹脅迫下，植物的凈光合速率可作為檢驗應試樹種對于水淹脅迫下光合生理生態響應能力的核心表征因子[15-17]。Pezeshki 等[18]曾提出“耐淹能力較強的樹種在水淹初期凈光合速率會有所下降，后期將逐步趨于穩定狀態”，即對于一部分樹種而言，植物會在遭受水淹后的幾小時到幾天時間內由于氧氣的缺乏而明顯降低其凈光合作用[19-20]，但隨著水淹時間的延長，耐淹樹種通常通過發酵作用來保持其能量需求，一般其Gs、Pn的變化規律保持一致，即：在水淹初期，植物氣孔縮小，吸收CO2能力減弱，植物由于光合相關酶底物減少而降低光合作用[21-22]，但隨脅迫時間增加，其自身產生適應，使得光合作用逐漸恢復或穩定[23]，從而使植物凈光合作用逐漸恢復至正常水平或達到相對穩定狀態；而非耐淹性物種則由于不適應這種水淹脅迫環境使自身光合作用下降，最終導致其死亡。因此，植物的恢復能力因物種類別、水淹脅迫強弱及水淹持續時間的不同而呈現出不同的響應變化。在本研究中，經過150 d 的水淹脅迫后，根淹組1、全淹組2、根淹組3 和全淹組4 濕地松的Pn分別比初始值下降30.9%、33.0%、51.9%、62.3%；根淹組1 和全淹組2 植物的凈光合速率隨著時間增加逐漸呈現出“下降-平緩”的趨勢，但根淹組3 和全淹組4 植株的凈光合速率處于一直下降的趨勢。出現上述現象的原因主要是由于濕地松對不同程度水淹脅迫環境的適應策略及耐受性不同。在水淹過程中，根淹組1 和全淹組2 植物試圖通過莖的伸長“逃離”水淹環境，由于莖的伸長生長過程中細胞的分裂及新細胞壁的生成需要大量的能量和碳水化合物的供給，因此，植株需要提高或維持穩定的光合速率[24]，這與衣英華等[25]對楓楊（Pterocarya stenoptera）進行的淹水脅迫研究結果類似。而根淹組3 和全淹組4 的植物由于前期干旱脅迫所造成的植物各方面的損傷，使其對全淹環境的耐受力下降，可能無法長期適應全淹及根淹環境。

氣孔的開放與關閉影響著植物蒸騰作用的強弱。植物氣孔關閉，植物對CO2的獲取量減少，植物進行光合作用所需光合酶底物減少，Pn降低[26]。Farquhar 等[26]提出衡量植物Pn下降的2 個指標：Ci和氣孔限制值（Ls）（Ls=1-(Ci/Ca)。如果Pn和Ci同時下降，Ls上升，說明Pn降低主要是由于氣孔限制引起的；如果Pn下降，而Ci上升，則表明Pn降低主要是由于非氣孔限制所致[27]。本研究中，濕地松隨著水淹時間的增加，各水淹脅迫組濕地松的Pn和Ci下降，而Ls隨著水淹時間的增加先增加后降低再增加，這可以說明濕地松Pn下降的主要決定因素前期是由氣孔因素決定的；而后期則大多由非氣孔因素所決定。這與前期學者對消落帶適生植物中華蚊母樹[28]等研究結果一致。這也表明氣孔關閉是植物最早對水淹作出的響應之一；隨水淹脅迫程度加深，植物開始受非氣孔因素的限制。另外，還有研究表明，植物與土壤之間的水力導度下降將會與根系缺氧一樣，也會引起植物Pn和Gs降低[29]，但在本研究中，濕地松受到水淹脅迫后的植物根系和土壤之間的水力導度是否下降有待于進一步的驗證。

4.2 冬季水淹脅迫對濕地松生理生化指標的影響

可溶性蛋白一定程度上可保護酶活性同時維持植物組織細胞膜的正常結構和功能。有研究指出，受水淹影響，植株內蛋白質的合成過程會受阻[30]。本研究顯示，根淹組植株可溶性蛋白在淹水階段大多與對照組差異不顯著，表明植株在部分水淹環境下蛋白質的合成基本不受抑制；而全淹組的濕地松針葉內可溶性蛋白含量在淹水初期（水淹60 d）出現了顯著的增加，而在水淹后期逐漸下降，可能是由于全淹植物受脅迫程度更大，積累的高濃度可溶性蛋白可一定條件下維持細胞較低的滲透勢，提高植株耐淹性，進而減輕植物受損害程度，這可能是濕地松為適應水淹脅迫環境而產生的一種自身適應性。

植株為抵御淹水脅迫下過多活性氧自由基對自身正常生命活動造成的傷害，形成了一整套復雜的抗氧化酶系統，可以清除體內多余的活性氧自由基（ROS），使其產生與清除達到動態平衡，從而維持植物正常呼吸作用[31]。Fadzilla 等[32]、Yang 等[33]以及吳寒[34]研究指出，“SOD 是植物體內防御自由基毒害的一種關鍵酶”。因此，植物體內的過氧化氫酶、過氧化物酶以及超氧化物歧化酶等協同作用可以減輕這些過量自由基的存在對植物細胞膜的傷害[35]。國內很多學者對消落帶適生植物等研究表明：耐淹植物均可通過提高體內抗氧化酶活性減輕過多自由基對自身產生的傷害[22,29,36-39]。本次對不同淹水脅迫處理下濕地松的抗氧化酶活性進行研究得出：在水淹7 d，濕地松體內SOD 活性并沒有顯著改變，而在水淹7～15 d 變化較大，這可能是由于前期濕地松體內的非酶促抗氧化系統發揮了重要作用，而隨脅迫程度加劇，植物開始通過提高植物體內SOD、CAT 和POD 活性減輕對植株的傷害。

自由基傷害學說已成為學者用于研究植物在逆境條件下細胞毒害機理的有效途徑[40]。MDA 可與細胞內的蛋白質、核酸等大分子發生反應，使蛋白質和核酸變性，影響細胞的結構和功能，最終導致細胞死亡[41]。本試驗中對濕地松針葉中的MDA 含量測定得出：不同淹水處理下，濕地松在水淹30 d內MDA 含量均與對照組相比差異不顯著，體現了濕地松對于短期淹水具有較強的適應性，但隨水淹時間的延長，濕地松針葉中的MDA 含量顯著增加并逐漸穩定在一定水平，包括本試驗在內的多個對消落帶適生植物的研究中均發現這種現象[36,40-41]?？傊?，濕地松在面對雙重脅迫下，不同脅迫因子之間發生了或協同或拮抗作用。

5 結論

本研究中，濕地松幼苗在模擬夏季干旱-冬季淹水的交替生境變化條件下具有一定的適應性，但模擬試驗在水體溫度與成分、水體流動性（溶解氧含量等）、渾濁度（光線可透性）、土壤結構與養分條件以及光照等環境條件方面很難與消落帶實際生境變化完全匹配，因此，植物的生理代謝活動等模擬試驗結果是否與實際生境植物的表現一致，還需要后續實地調查進行驗證。因此，本課題組會在后期通過建立消落帶長期監測固定樣地或者示范區，以求探究植物在原始生境環境下的適應機制以及抗逆性。