毛果楊MAP65 基因家族的擴張與表達分析

薛 麗，劉曉霞，羅 瑩，呂中睿，張建國,2,3，饒國棟,2,3＊

(1. 林木遺傳育種國家重點實驗室，中國林業科學研究院林業研究所，北京 100091；2. 南京林業大學，南方現代林業協同創新中心，江蘇 南京 210000；3. 國家林業和草原局林木培育重點實驗室，中國林業科學研究院林業研究所，北京 100091)

微管是由α、β-微管蛋白以異二聚體的形式組裝而成的中空管狀結構[1]。植物細胞中，微管可以快速的聚合或者解聚、迅速轉變微管列陣，對細胞的正常擴張和分化具有重要作用。微管結合蛋白(MAP)是一類對微管的組裝和功能具有調控作用的蛋白[2]。Changjie 等最早從煙草(Nicotiana tabacumL.) BY-2 (‘Bright Yellow-2’)懸浮培養細胞中分離得到一類與微管緊密結合且分子量約為65 kD 的蛋白，即MAP65[3]。MAP65 蛋白通常定位于一種或幾種微管列陣上，是一類可與微管交聯并促進微管成束的微管結合蛋白[4]。

從煙草BY-2 懸浮培養細胞中分離出小原生質體，制備胞質提取物，之后加入紫杉醇協助組裝微管，再將微管和MAP 低溫高速離心以去組裝，經過數次組裝-去組裝循環，分離得到3 個煙草MAP65蛋白[5]。后用同樣的方法在胡蘿卜(Daucus carotaL.)懸浮細胞中分離得到3 個胡蘿卜MAP65 蛋白[6]。隨著擬南芥(Arabidopsis thaliana(L.) Heynh.)與水稻(Oryza sativaL.)基因組測序的完成，擬南芥和水稻中分別鑒定出了9 和11 個MAP65 蛋白家族成員[7-8]。小立碗蘚 (Physcomitrella patens(Hedw.)Bruch & Schimp.)中克隆得到了5 個MAP65基因[9]。對擬南芥MAP65 蛋白家族的研究表明，9 個成員之間氨基酸相似性為28%～79%，C 端序列同源性尤其低，C 端包含與微管特定結合的結構域，決定了微管聚合的速率，不同基因的C 端微管結合結構域不同，故以不同的效率促進微管聚合[10]。ATMAP65-1和ATMAP65-2促進擴增細胞的軸向生長，但不是維持細胞營養生長和生殖生長所必需[11]。ATMAP65-3的缺失導致成膜體異常，胞質分裂不完全及植株發育異常[12]。ATMAP65-4和ATMAP65-3具有高度同源性，功能相似，交聯成膜體中的相鄰反向平行的微管，這2 個基因的同時缺失會導致植株生長受到嚴重影響[13]。ATMAP65-5在整個細胞周期中均有表達，且對微管解聚藥具有更強的耐受力[14]。ATMAP65-6對微管聚合沒有促進作用，但可誘導微管形成網狀結構，該蛋白定位于線粒體，可能參與線粒體相關功能的實現[15]。植物中MAP65基因家族的成員數量較多，且在細胞周期的不同微管列陣中具有不完全相同的定位模式，在不同組織中的表達量亦存在差異，這預示該基因家族在植物中具有功能的分化[10,16-17]。

毛果楊(Populus trichocarpaTorr. & Gray)作為第一個完成基因組測序的木本植物，為鑒定木本植物MAP65基因家族成員和分析其進化及功能提供了可能[18]。本研究在毛果楊中鑒定出9 個MAP65，通過其理化性質分析、亞細胞定位的預測、系統進化分析、基因結構和保守結構域分析、共線性分析及同義突變頻率 (Ks)、非同義突變頻率(Ka)分析、組織表達量以及啟動子順式作用元件分析，探究了PtMAP65基因家族的進化擴張模式，以期揭示PtMAP65基因家族的進化生物學意義，并為進一步研究PtMAP65基因家族成員的潛在功能提供新的線索。

1 材料與方法

1.1 PtMAP65 基因家族成員的鑒定及理化性質分析

在擬南芥數據庫(https://www.arabidopsis.org)下載ATMAP65基因家族9 個成員的蛋白質序列，將其作為靶序列，使用BLASTP 方法在Phytozome(v12.1，https://phytozome.jgi.doe.gov/) 中的毛果楊v3.1 蛋白質組數據庫中進行搜索，期望閾值設為-10，其他參數默認；候選基因再通過在線工具SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)和NCBICDD (https://www.ncbi.nlm.nih.gov)進行保守結構域鑒定，最后得到9 個PtMAP65 蛋白。利用Prot-Param(https://web.expasy.org/)計算PtMAP65 蛋白家族的分子量和等電點；利用Plant-mPLoc(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/)、 LocTree3 (https://rostlab.org/)和 Wolfpsort (https://www.genscript.com/)預測PtMAP65 蛋白家族的亞細胞定位。

1.2 植物MAP65-Likes 基因系統進化樹的構建

利用MAGA7.0 中的ClustalW 程序，將毛果楊、擬南芥、煙草、水稻、玉米(Zea maysL.)、巨桉(Eucalyptus grandisHill)、挪威云杉(Picea abies(L.) Karst.)、北美云杉(Picea sitchensis(Bongard)Carrière)、萊 茵 衣 藻(Chlamydomonas reinhardtiiP.A.Dangeard)等物種的MAP65-Like 蛋白序列進行多重序列比對；以萊茵衣藻作為外類群，采用鄰接法(NJ)構建系統進化樹，模型為p-distance，成對刪除，校驗參數(Bootstrap) 為1 000 次和5 000 次重復。毛果楊、擬南芥、煙草和水稻MAP65 蛋白家族系統進化樹構建方法同上。

1.3 毛果楊、擬南芥、煙草和水稻MAP65 家族成員的基因結構和保守結構域分析

利用GSDS (2.0, http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)分析毛果楊、擬南芥、煙草和水稻MAP65s的基因結構；利用MEME (v5.1.1, http://meme-suite.org/)分析其蛋白序列的保守結構域，最大結構域數目設置為15。

1.4 毛果楊染色體定位、共線性分析及Ka/Ks 計算

從毛果楊基因組注釋文件中獲得PtMAP65基因家族染色體定位的位置信息；在linux 系統下利用MCScanX 進行毛果楊基因組內共線性分析，并使用TBtools (v0.6696)作圖。利用BioEdit Sequence Alignment Editor 比對復制基因對的CDS 序列，再用DnaSP5 計算復制基因對的Ks和Ka，根據Ks值計算進化時間(T)：T=Ks/2λ，λ = 9.1 × 10-9[19]。

1.5 PtMAP65 基因家族成員啟動子順式作用元件分析

使用TBtools (v0.6696)從毛果楊基因組序列文件中獲取PtMAP65基因家族成員起始密碼子上游2 000 bp 的DNA 序列作為啟動子，使用plantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)分析啟動子中的順式作用元件。

1.6 PtMAP65 基因家族成員表達特性

PtMAP65基因家族成員在不同組織中的表達數據來源于Poplar eFP Browser (http://bar.utoronto.ca/)，利用TBtools (v0.6696)分析制作基因表達熱圖，取log scal，極限值設置為2 000，其他參數默認。

2 結果與分析

2.1 PtMAP65 基因家族成員的鑒定與理化性質分析

通過在線BLASTP 比對，從毛果楊中鑒定出14 個候選的MAP65s。SMART 和NCBI-CDD 分析結果顯示：14 條蛋白序列都具有完整或不完整的MAP65_ASE1 結構域 (PF03999)；經過比對建樹分析，刪除影響樹形的序列，最后得到9 個MAP65s。根據其在染色體上的分布情況，將其命名為PtMAP65-1到PtMAP65-9（表1）。PtMAP65 蛋白家族成員的氨基酸長度變化范圍為570～730 aa，分子量變化范圍為64.65～83.00 kDa，等電點變化范圍為5.17～8.45。綜合考慮PtMAP65 蛋白家族成員用3 種方法預測的亞細胞定位，最終預測：PtMAP65-1、PtMAP65-3 和PtMAP65-9 位于細胞核，PtMAP65-8位于葉綠體，其余成員位于細胞質。

表1 PtMAP65 基因家族及其理化性質Table 1 The information of the PtMAP65 gene family

2.2 植物MAP65-Likes 系統進化分析

為研究植物MAP65-Likes 的系統進化關系，采用鄰接法對毛果楊、擬南芥、煙草、水稻、巨桉、挪威云杉等物種的MAP65-Like 蛋白構建系統進化樹，校驗參數(Bootstrap) 分別為1 000 次和5 000 次重復，結果差異很小，圖1 中系統進化樹的Bootstrap 為1 000。從圖1 可以看出：該植物基因家族分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ5 個亞組，裸子植物的MAP65-Likes僅分布于Ⅰ亞組和Ⅴ亞組中，且獨立地聚為一簇；被子植物的MAP65-Likes在5 個亞組中均有分布，且單子葉和雙子葉植物MAP65s均勻地分布于各個亞組，這說明5 個亞組的分化發生于裸子植物和被子植物分化之后、單子葉植物和雙子葉植物分化之前。在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ4 個亞組中，單子葉植物和雙子葉植物的MAP65-Likes各自聚為一簇，在Ⅴ亞組中，雙子葉植物毛果楊、擬南芥和煙草的4 個MAP65-Likes聚為一簇，其他8 個MAP65-Likes與單子葉植物水稻的3 個MAP65s聚為一簇。在Ⅰ亞組中，PtMAP65-2/PtMAP65-6組成旁系同源基因對，并與ATMAP65-1/ATMAP65-2這一對旁系同源基因聚為一支；在Ⅱ亞組中，PtMAP65-4/Eucgr.J00083.1組成直系同源基因對,并與ATMAP65-5聚為一支；在Ⅲ亞組中，PtMAP65-1/PtMAP65-3組成旁系同源基因對，并與Eucgr.B03489.1聚為一支；在Ⅴ亞組中，PtMAP65-7/PtMAP65-9組成旁系同源基因對，并與旁系同源基因對Eucgr.K00145.1/Eucgr.A02875.1聚為一支，另外，PtMAP65-8/ATMAP65-4組成直系同源基因對；在Ⅳ亞組中，PtMAP65-5/Eucgr.G02071.1組成直系同源基因對，這表明MAP65 家族中毛果楊與巨桉的親緣關系最近，這也與二者是多年生木本植物相一致。

2.3 毛果楊、擬南芥、煙草和水稻MAP65 家族成員的基因結構和保守結構域分析

圖1 植物MAP65-Likes 系統進化分析Fig. 1 Phylogenetic analysis of plant MAP65-Likes protein sequences

圖2 MAP65 家族的基因結構和保守結構域分析Fig. 2 Gene structures and protein domains analysis of MAP65 gene family

為分析MAP65家族成員的基因結構特征，利用GSDS 繪制了毛果楊、擬南芥、煙草和水稻MAP65家族成員的基因結構圖。圖2A 表明：在Ⅰ亞組中，9 個MAP65s有9 個外顯子、8 個內含子，僅ATMAP65-1有8 個外顯子、7 個內含子；在Ⅱ亞組中，MAP65有11 個外顯子、10 個內含子；在Ⅲ亞組中，3 個MAP65有11 個外顯子、10 個 內 含子，LOC_Os08g41890.1有10 個 外 顯子、9 個內含子；在Ⅳ亞組中，5 個MAP65有11 個外顯子、10 個內含子，僅LOC_Os03g50970.1有13 個外顯子、12 個內含子；在Ⅴ亞組中，MAP65的外顯子個數為9～12、內含子個數為8～11。另外，在各個亞組中，外顯子的長度相似，內含子的長度差異較大，而同一物種的MAP65之間的內含子長度更相似。

利用MEME 分析了MAP65 蛋白家族的保守結構域。圖2B 表明：各個MAP65 蛋白家族成員具有11～15 個不等的結構域，第1、2、3、4、6、7、8、9、11、12 和15 個結構域較保守，在32 條MAP65 蛋白序列中均有分布。另外，植物MAP65 蛋白序列的C 端結構域較多變，各個亞組的MAP65 蛋白具有相似的結構域分布。

2.4 PtMAP65 基因家族的染色體定位和進化擴張

根據毛果楊基因組序列文件和注釋文件，分析了9 個PtMAP65基因在染色體的定位情況。PtMAP65-1和PtMAP65-2位于Chr01，PtMAP65-3和PtMAP65-4位于Chr03，PtMAP65-5到PtMAP65-9分別位于Chr08、Chr11、Chr12、Chr14 和Chr15。毛果楊基因組內共線性分析結果顯示：MAP65基因家族中共有6 對復制基因，且均為片段復制，其中PtMAP65-7、PtMAP65-8和PtMAP65-9互為復制基因(圖3)。利用DnaSP5 計算復制基因對的Ka和Ks，算得的Ks值為0.234 1～1.933 8，表明復制時間最早發生于106.25 百萬年前，最晚發生于12.86 百萬年前；除復制基因對PtMAP65-4/Potri.001G032566的Ka/Ks 為0.617 3 外，其余復制基因對的Ka/Ks＜ 0.25，表明PtMAP65基因家族在進化過程中受到強純化選擇的作用(表2)。

圖3 PtMAP65 基因家族染色體分布與復制基因對Fig. 3 Chromosomal locations and duplicated gene pairs of PtMAP65 gene family

表2 復制基因對的Ks、Ka 分析Table 2 Ks and Ka analysis of duplicated gene pairs

2.5 PtMAP65 基因家族的啟動子順式作用元件分析

為了解轉錄調控機制，利用PlantCARE 數據庫分析PtMAP65基因家族啟動子的順式作用元件。根據順式作用元件的功能，將其分為光響應元件、激素響應元件、逆境脅迫響應元件和植物生長發育元件。圖4 表明：在PtMAP65基因家族中，光響應元件和激素響應元件的個數較多，逆境脅迫響應元件和植物生長發育元件的個數較少；PtMAP65-3中的激素響應元件遠多于其他基因，PtMAP65-4、PtMAP65-7和PtMAP65-8中未預測到植物生長發育元件。

圖4 PtMAP65 基因家族啟動子的順式作用元件分析Fig. 4 Cis-elements analysis of PtMAP65 gene family promoter

2.6 PtMAP65 基因家族的組織表達模式分析

從Populus eFP browser 數據庫下載得到PtMAP65基因家族成員在成熟葉、幼葉、根、雌花、雄花和木質部中的表達數據，繪制熱圖。圖5表明：復制基因對PtMAP65-2/PtMAP65-6在幼葉、根和木質部均有高度表達；復制基因對PtMAP65-7/PtMAP65-8在雌花和雄花中高度表達；PtMAP65-3在木質部中表達量最高；PtMAP65-1和PtMAP65-4主要在幼葉和雌花中表達；PtMAP65-5在幼葉和根中表達水平較高；PtMAP65-9在各個組織表達水平較低。

3 討論

MAP65 蛋白最早在煙草中發現，是一類具有穩定微管功能的蛋白[3]。本研究在毛果楊中鑒定出9 個PtMAP65基因，保守結構域分析發現，MAP65_ASE(pfam03999)結構域普遍存在于擬南芥、毛果楊、水稻和煙草MAP65 蛋白家族中[16]，暗示MAP65_ASE 為植物MAP65 家族行使共同功能的主要結構域。研究發現，植物MAP65的C 端包含一個高度分化的微管結合結構域[20]，這個結構域參與微管聚合、成束，且對其亞細胞定位有一定影響[21]，在有絲分裂中期，C 端蛋白的磷酸化可及時地下調MAP65與微管的結合[22-23]。進一步分析發現，毛果楊PtMAP65 蛋白的C 端同樣包含一個高度分化的微管結合結構域，這可能與毛果楊MAP65家族的功能分化相關。

圖5 PtMAP65 基因家族在不同組織中的表達模式Fig. 5 Expression profiles of PtMAP65 gene family in different tissues

片段復制和串聯復制是基因家族擴張的主要動力[24]。毛果楊基因組內共線性分析發現，PtMAP65基因家族中共有6 對復制基因，且均為片段復制，這說明片段復制是PtMAP65基因家族進化擴張的主要動力。毛果楊經歷了3 次全基因組復制事件，分別是古老的復制事件、100～120 百萬年前的真薔薇分支復制事件和60～65 百萬年前的楊柳科復制事件[18]。分析PtMAP65復制基因發生時間發現，PtMAP65-7/PtMAP65-8、PtMAP65-8/PtMAP65-9的復制時間與真薔薇分支復制事件接近，PtMAP65-7/PtMAP65-9的復制大約發生于為13 百萬年前，由此推測，位于Chr14 的PtMAP65-8經過2 次片段復制或者三倍化復制得到位于Chr12 的PtMAP65-7和位于Chr15 的PtMAP65-9。最新研究表明，被子植物在20 百萬年前亦發生了1 次全基因組復制事件，當時氣溫和CO2濃度均較低，保留下來的基因多與鹽脅迫、低溫脅迫、干旱脅迫等非生物脅迫有關[25]。分析發現，PtMAP65-1/PtMAP65-3、PtMAP65-2/PtMAP65-6、PtMAP65-4/Potri.001G032566.2，PtMAP65-7/PtMAP65-9這4 對基因的復制時間均與此次全基因組復制事件的時間相吻合。

通過對植物MAP65系統發育關系的研究發現，PtMAP65多與ATMAP65或巨桉MAP65聚為一支，這說明毛果楊和擬南芥、巨桉的親緣關系最相近。前人研究表明：ATMAP65-1定位于除萼片和花藥以外的所有植物器官和組織，且在根表皮細胞、子葉和下胚軸細胞中發現ATMAP65-1蛋白與微管相結合，在體外ATMAP65-1在微管之間形成25 nm 的交聯橋，促進微管成束[26]；ATMAP65-2在調節細胞的軸向生長方面具有重要作用；在ATMAP65-1和ATMAP65-2雙突變體中，沒有觀察到明顯的膨脹、變形和其他形態學缺陷的細胞，但植株生長顯著遲緩[11]。分析發現，PtMAP65-2、PtMAP65-6與ATMAP65-1、ATMAP65-2聚 為 一支，位于Ⅰ亞組，且其在雄花和雌花中表達量低，在其他組織中表達量均較高，這暗示PtMAP65-2和PtMAP65-6可能通過參與細胞骨架的構建進而影響植株形態發生。ATMAP65-3與有絲分裂微管列陣緊密相關，在有絲分裂過程中，該蛋白組織紡錘體形態發生和成膜體形成，ATMAP65-3基因突變體根尖、莖尖分裂能力弱，植株矮小[27]；引入ATMAP65-4拷貝基因的植株顯著抑制了由ATMAP65-3突變引起的細胞質分裂和幼苗生長缺陷，而ATMAP65-3和ATMAP65-4的同時突變將導致植物死亡[13]。分析發現，PtMAP65-7/PtMAP65-9與ATMAP65-3聚為一簇，PtMAP65-8與ATMAP65-4聚為一簇，位于Ⅴ亞組，暗示PtMAP65-7、PtMAP65-8和PtMAP65-9這3 個基因通過參與細胞分裂過程決定植物的生長發育情況，但這3 個基因在毛果楊的各個組織中表達量較低，其中的調控方式尚需進一步實驗來明確。ATMAP65-8在與周質微管的結合較弱，可能僅結合周質微管中的某一部分[28]。分析發現，PtMAP65-1/PtMAP65-3與ATMAP65-8聚為一支，位于Ⅲ亞組，這對基因的復制發生于20 百萬年前的全基因組復制事件，預測的亞細胞定位在細胞核，特別的是：PtMAP65-3啟動子上的激素響應元件遠遠高于其他基因，且該基因在木質部高度表達，推測PtMAP65-3可能通過參與各種非生物脅迫響應而影響植物次生生長。綜上，PtMAP65-1、PtMAP65-2、PtMAP65-3、PtMAP65-6、PtMAP65-7、PtMAP65-8和PtMAP65-9可能緊密結合微管，通過影響細胞分裂進而影響植物生長，具體的作用機制及生物學功能仍需進一步研究。

4 結論

本研究利用BLASTP 比對，在毛果楊中鑒定了9 個PtMAP65s；構建多個物種的MAP65s系統進化樹，將其分為5 個亞組；按不同亞組將基因結構圖和保守結構域圖歸類比較，同一亞組的MAP65s具有相似的基因結構和保守結構域；利用毛果楊基因組內共線性及Ka、Ks分析PtMAP65基因家族的進化，片段復制是其擴張的主要動力，且復制基因在進化過程中受到強純化選擇的作用；亞細胞定位預測、基于芯片數據的表達量和啟動子的順式作用元件綜合分析表明：在PtMAP65基因家族中，不同亞組間的PtMAP65s已經存在功能分化，同一亞組內的PtMAP65s即復制基因對之間仍存在功能冗余。