脫落酸噴施差異調控橡膠樹熱研73397和熱研917生長和抗逆基因響應機制

樊松樂 王紀坤 安鋒 謝貴水 王立豐

(1 農業農村部橡膠樹生物學與遺傳資源利用重點實驗室/省部共建國家重點實驗室培育基地-海南省熱帶作物栽培生理學重點實驗室/農業農村部儋州熱帶作物科學觀測實驗站/中國熱帶農業科學院橡膠研究所 海南海口 571101;2 海南大學熱帶作物學院/海南省熱帶生物資源可持續利用重點實驗室 海南海口 570228)

脫落酸（abscisic acid，ABA）是一種加速果實脫落的植物激素，參與調控植物許多生理過程和逆境脅迫反應。巴西橡膠樹起源于南美洲的亞馬遜河流域，中國屬于非傳統植膠區，橡膠樹種植常會受到干旱［1］、低溫［2］等非生物脅迫及白粉病［3］等生物脅迫，制約天然橡膠產業發展。

適當濃度外源ABA的施用可提高橡膠樹的抗寒性、導致橡膠樹產生逆境脅迫進而影響體內相關基因的表達。王紀坤等［4］研究表明，25 mg/L ABA預處理在4℃低溫環境生長的熱研73397 芽接苗，在0～144 h 期間，葉片中的超氧化物歧化酶（SOD）活性先降低后增加，過氧化物酶（POD）活性先降低，24 h 后趨于穩定且25 mg/L ABA 處理后抗寒效果最好。王紀坤等［5］研究發現，脫落酸、干旱、吲哚乙酸等處理橡膠樹芽接苗后，HbPRX53的表達上調，推測HbPRX53與橡膠樹抗逆密切相關。歐陽沫等［6］研究表明100 μmol/L ABA 處理橡膠樹熱研73397幼莖后，橡膠樹HbICE1（冷脅迫信號轉導通路的重要轉錄因子）基因受ABA調控。何海霞等［7］研究表明，200 μmol/L ABA 處理橡膠樹芽接苗后，ABA 可誘導Hbmlo7基因顯著上調表達。陸燕茜等［8］研究表明，HbMYB62表達量在200 μmol/L ABA 處理橡膠樹芽接苗后先顯著上調后下調。張宇航等［9］利用ABA 和GA3分別為200 和100 μmol/L 處理橡膠樹組培苗，結果表明植物生長調控因子GRF 家族成員HbGRF1、HbGRF2和HbGRF3基因受ABA 和GA3調控。橡膠樹抗寒劑對橡膠樹熱研73397 和熱研879 等橡膠樹品種芽接苗及寒害樹割膠面有顯著防護和恢復效果［10］。ABA的生物合成及其運輸方式、分解代謝、信號轉導途徑、模式植物相關脅迫誘導基因的表達調控等內容研究較多且比較深入。然而，抗寒劑主要成分ABA對不同抗性品種間橡膠樹生長和抗逆性的影響機制尚不清楚。為了分析抗寒劑主要成分ABA對橡膠樹不同抗性品種生長和抗逆性調控機制，本研究利用120 μmol/L ABA 處理橡膠樹熱研73397 和熱研917，分析其定位于線粒體和葉綠體相關基因HbCOA、Hb‐COAL、HbCOXI、HbCAX，能量和蛋白合成相關基因HbCBP、HbASRLP1、HbATP和HbRbsS，幾個關鍵的抗氧化酶HbAPX、HbCAT、HbCuZnSOD、HbMnSOD基因的表達規律。揭示ABA對橡膠樹中抗和高抗性品種生長和抗逆響應基因表達的作用機制。本研究將為闡明橡膠樹抗寒劑主要成分ABA對橡膠樹生長和抗逆的響應機制提供理論指導及為抗逆技術研發打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試材

供試的橡膠樹品種為熱研73397 和熱研917 組培苗（株高0.8～1 m），由中國熱帶農業科學院橡膠研究所儋州基地國家橡膠樹種質資源圃提供。

1.1.2 試劑與儀器

多糖多酚植株總RNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司。反轉錄試劑盒、DL 2000 DNA Marker購自寶生物工程有限公司。ChamQ Univer‐sal SYBR qPCR Master Mix 購自南京諾唯贊生物科技有限公司。主要設備儀器為Thermo Fisher NanoDrop 2000 超微量核酸蛋白分析儀（Gene Company Limited，上海）和伯樂熒光定量PCR 儀（美國）。

1.2 方法

1.2.1 脫落酸處理橡膠樹組培苗

用0.05% （V/V） 的乙醇水溶液來溶解配置120 μmol/L 脫落酸（CAS 號：14375-45-2，Merck KGaA，Darmstadt，Germany），處理采用裝有120 μmol/L 脫落酸噴壺噴施處理熱研73397 和熱研917兩品種組培苗葉片，對照噴施0.05%（V/V）的乙醇水溶液，分別在處理后0、0.5、2、6、10、24、48 和72 h 采集葉片樣品，用液氮速凍后保存到-80℃冰箱。

1.2.2 橡膠樹葉片RNA提取和cDNA合成

橡膠樹葉片RNA 方法參照TIANGEN RNA 提取試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司，北京，中國］的方法，提取不同采樣時間處理和對照組培苗葉片RNA，RNA 濃度與純度檢測使超微量核酸蛋白分析儀用（Thermo Fisher NanoDrop 2000，Gene Company Limited，上海）。cDNA 的合成參考陸燕茜［8］的方法，以反轉錄得到的cDNA 為模板，擴增內參基因Hb18S，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性和內參基因擴增效果。

1.2.3 基因表達分析

HbCOA、HbATP、HbRbsS、HbACAT、HbCOAL、HbCOXI、HbCAX、HbCBP、HbASRLP1、HbAPX、Hb‐CAT、HbCuZnSOD和HbMnSOD熒光定量引物序列（表1）參考wang［11-12］。選用橡膠樹Hb18S為內參基因，SYBR Green 法進行定量PCR 檢測（伯樂熒光定量PCR 儀），熒光定量PCR（qRT-PCR）反應體系和程序參照肖化興等［13］方法。

1.2.4 數據統計分析

采用Excel2016 進行數據整理處理，SAS 軟件分析差異顯著性（單因素ANOVA 檢驗），Origin‐Pro2018 （Origin Lab Corporation，Massachu‐setts，USA）進行作圖。

2 結果與分析

2.1 ABA處理后ROS清除系統關鍵酶基因表達規律

為了分析ABA處理對橡膠樹抗逆性的影響，利用熒光定量PCR 分析橡膠樹熱研73397 和熱研917葉片中ROS 清除系統關鍵酶基因的表達模式。ABA噴施熱研73397 葉片后，HbAPX、HbCAT、HbCuZn‐SOD和HbMnSOD基因在0.5 h時表達量上調，10 h 達到峰值，之后表達量下調。48 h相比較24 h時顯著上調，72 h 時基因表達量降到最小值。4 個基因表達量呈現先上調后下調的趨勢，表達模式一致。HbAPX、HbCAT、HbCuZnSOD和HbCuZnSOD基因10 h表達量分別是0h 的8.6、10.9、9.3 和3.8 倍（p＜0.01）。ABA 噴施熱研917 葉片后，HbAPX、HbCAT、HbCuZnSOD和HbMnSOD基因0～72 h 呈現下調趨勢，HbAPX、HbCAT、HbCuZnSOD和HbCuZnSOD基因均在0.5 h 時表達量達到最低，相比較0h 時表達量分別下 調97.6、87.4、42.0 和109.6 倍 左 右（p＜0.01，圖1）。

表1 熒光定量引物序列

2.2 ABA 處理后定位于線粒體和葉綠體相關基因HbCOA、HbCOAL、HbCOXI和HbCAX的表達規律

圖1 ABA處理后ROS清除系統相關基因HbAPX、HbCAT、HbCuZnSOD和HbMnSOD的表達規律

為了分析ABA 處理對橡膠樹熱研73397 和熱研917 生長的影響，通過qRT-PCR 技術分析定位于線粒體和葉綠體相關基因HbCOA、HbCOAL、HbCOXI和HbCAX的表達模式。ABA 處理后，熱研73397 葉片中的HbCOA和HbCOXI在0～72 h 基因表達量均在48 h時達到峰值；HbCOAL和HbCAX在0～72 h基因表達趨勢一致，均在10 h 時基因表達量最高。ABA 處理后，熱研917 葉片中HbCOA、HbCOAL、HbCOXI和HbCAX的表達模式一致，0～72 h 呈現下調趨勢且均在0.5 h 時基因表達量達到最小值，相比較0 h時表達量分別下調69.6、80.7、37.9和80倍（p＜0.01，圖2）。

2.3 ABA 處理后能量和蛋白合成HbCBP、HbAS?RLP1、HbATP和HbRbsS的表達規律

為了分析ABA 處理對橡膠樹熱研73397 和熱研917 能量消耗和蛋白合成的情況，通過qRT-PCR 技術分析能量合成相關基因HbCBP、HbASRLP1、HbATP和HbRbsS的表達模式。ABA 噴施熱研73397葉片后，HbCBP、HbASRLP1、HbATP和HbRbsS基因在0.5 h 時表達量顯著上調，10 h 達到峰值，之后表達量下調，48 h相比較24 h時顯著上調，72 h時基因表達量降到最小值，HbCBP、HbASRLP1、HbATP和HbRbsS基因10 h 表達量分別是0 h 的8.9、10.8、5.3、9.7倍（p＜0.01），HbCBP、HbASRLP1、HbATP和HbRbsS基因具有一致的表達模式。ABA 噴施熱研917 葉片后，HbCBP、HbASRLP1、HbATP和HbRbsS基因0～72 h呈現下調趨勢，HbCBP、HbASRLP1、HbATP和HbRbsS基因均在0.5 h 時表達量達到最低，相比較0 h 時表達量分別下調62.4、56.29、51.3和61.3倍（p＜0.01，圖3）。

3 討論與結論

3.1 討論

圖2 ABA處理后HbCOA、HbCOAL、HbCOXI和HbCAX的表達規律

圖3 ABA處理后能量和蛋白合成相關基因HbCBP、HbASRLP1、HbATP和HbRbsS的表達規律

ABA 信號通路由ABA 特異性受體PYR1（pyn‐bactin resistance 1）、PYR1 類 似 蛋 白（PYLs/RCARs）、下游的磷酸酶（clade-A PP2C）和蛋白激酶（SnRK2） 組成。無ABA 時，ABA 特異 性 受體PYR1/PYLs/RCARs 無法結合到磷酸酶type 2C pro‐tein phosphatases（PP2Cs），PP2C 抑制激酶Sn‐fl-related protein kinase （SnRK2）的活性，抑制下游ABA 響應結合因子的活性；存在ABA 時，ABA 結合ABA 特異性受體PYR1/PYLs/RCARs，PP2Cs的活性被抑制，SnRK2 被磷酸化激活了下游ABA 響應結合因子、具有helix-loop-helix （HLH）結構的轉錄因子、ABI5 蛋白等［14-15］。植物遭受非生物脅迫比如施用外源ABA以及植物進行光合作用、呼吸作用等均可使植物體內產生活性氧（ROS）。植物體內存在的ROS清除系統包括非酶清除系統和酶清除系統［16］。

本研究利用qRT-PCR 分析120 μmol/L ABA 處理橡膠樹熱研73397 和熱研917 葉片中ROS 清除系統關鍵酶基因、定位于線粒體和葉綠體相關基因、能量合成相關基因的表達模式，熱研73397葉片中HbAPX、HbCAT、HbCuZnSOD、HbMnSOD、HbCBP、HbASRLP、HbATP、HbRbsS、HbCOAL和HbCAX基因在0.5 h 時表達量顯著上調。熱研917 葉片中上述基因在0～72 h 呈現下調趨勢，0.5 h 下調到最低值。說明二者對ABA 具有差異響應機制。HbCOA是一種長鏈-脂肪-酰基-輔酶a 還原酶基因（EC 1.2.1.50），在天然橡膠生物合成和ABA 合成中起重要作用［17］。抗壞血酸過氧化物酶基因HbAPX參與了抗氧化系統的研究［18］。在橡膠樹中，Hb‐CuZnSOD和HbMnSOD編碼了抗氧化超氧化物歧化酶，并證實了它們在干旱響應中的作用［19］。HbRbsS編碼一種參與碳固定的酶。HbATP編碼巴西橡膠樹線粒體ATP 合酶b 亞基，為植物體生理生化過程提供能量。HbCBP編碼一種檸檬酸結合蛋白質［20］。HbASRLP1是一種脫落酸應激蛋白。植物體內ROS清除，光合作用，膜通透性和其他細胞過程的酶活性以及代謝反應均與橡膠樹耐寒性相關［21-22］。Du等［23］研究表明，施外源ABA 使得土壤ABA 濃度達到10 μM 后，干旱脅迫下的春小麥品種（Triti‐cum aestivumL.、現代品種隴春8275）的抗氧化酶（SOD、CAT、APX 和GR）活性和葉片中ABA 含量均有提高，ROS 和脂膜過氧化物水平降低，籽粒蒸騰效率增加。后有麗等［24］研究表明6 mg/L 的外源ABA 處理紅砂葉片后，隨著處理天數的增加葉片中SOD、POD、CAT 活性總體均呈現先上升后下降的趨勢，與處理之前相比分別上升28.94%、35%、84.46%。ABA 緩解了由干旱脅迫引起的損害。Wang等［11］研究表明，干旱處理橡膠樹GT1實生苗，ROS清除系統和定位于線粒體和葉綠體相關基因CuZnSOD、HbMnSOD、HbAPX、HbCAT、HbCOA、HbATP和HbACAT的先顯著上調并在斷水3 d 時達到最大值，隨后斷水5 d 后下調。本研究在橡膠樹熱研73397葉片中的抗氧化酶基因的表達模式與wang等的研究一致，后有麗等測定的抗氧化酶活性變化趨勢也和本研究抗氧化酶基因的表達模式一致。光合作用是植物生長發育的基礎且低溫和光照強度對其影響較大，呼吸作用主要通過線粒體，而且線粒體和葉綠體在ABA生物合成和信號轉導發揮了重要作用，二者均可為植物體提供能量并且和植物的生長相關。

脫落酸在脅迫下調控光合作用中起重要作用。田禮新等［25］研究表明適當濃度的ABA 可提高玉米幼苗葉片的光合能量，提高PSⅡ反應中心活性進而增強耐冷性。陳靠山等［26］利用ABA 處理后提取玉米和大豆的線粒體，結果表明，ABA 增加線粒體的耗氧速率和呼吸作用。Travaglia 等［27］研究表明，外源ABA能提高田間小麥葉綠素、胡蘿卜素含量和小麥的產量。Teng 等［28］研究表明，在PEG 脅迫下，外源ABA的施用顯著提高了旱稻（UR）的凈光合速率、氣孔導度和蒸騰速率，增加了Os‐PsbD1、OsPsbD2、OsNCED2、OsNCED3、OsNCED4、OsNCED5的表達，在UR 遺傳背景中，葉綠體和ABA生物合成相關基因在外源ABA 誘導的光系統II（PSII）中發揮作用。植物體能量合成相關基因和ROS 清除系統關鍵酶基因的表達模式相似。本研究結果表明，中抗品種熱研73397葉片中的能量合成相關基因和ROS 清除系統關鍵酶基因受ABA 調控，在0～72 h 呈現先上調后下調的趨勢。HbATP基因表達趨勢和其他基因相似，在10 h 時基因表達量達到峰值，約是0 h 的5.4 倍。高抗品種橡膠樹熱研917 葉片中的能量合成相關基因和ROS 清除系統關鍵酶基因下調表達。

在植物中發現了2 種類型的冷馴化途徑：ABA依賴性途徑和ABA 非依賴性途徑［29］。ABA 依賴性途徑需要ABA 的積累和激活ABF、MYB、MYC 等轉錄因子，轉錄因子與ABRE、MYBRS 和MYVRS 順式作用元件結合激活RD22 和RD29B 等功能基因增強抗寒性；ABA 非依賴性途徑不需要ABA 激活基因，如ICEICBF 途徑，冷脅迫下ICE1 被激活進而誘導CBF 轉錄因子表達，CBF 與CRT/DRE 元件結合調控COR 基因的表達增強抗寒性［30-32］。Cheng 等［32］使用North‐ern 印跡分析了針對冷脅迫和ABA 處理的基因表達譜，研究表明橡膠樹HbCBF1響應冷脅迫，而對干旱或ABA脅迫無響應；利用遺傳轉化技術獲得Hb‐CBF1過表達擬南芥植株，研究發現HbCBF1過表達激活COR15a和RD29a基因的表達。

脅迫誘導ROS產生導致多不飽和脂質降解，形成丙二醛（MDA）。Yuan 等［31］研究表明35S：HbI‐CE1擬南芥植株抗寒性的提高是脯氨酸積累增加，電解質泄漏和MDA 代謝減少以及寒冷條件下H2O2積累減少的結果。王紀坤等［4］研究發現，50 mg/L ABA 處理在4℃人工氣候室生長的熱研73397 芽接苗，MDA 含量在0～144 h 呈現先下降后上升在降的趨勢，144 h 時，橡膠樹芽接苗葉片中的MDA 含量最低。Cheng等［30］在橡膠樹中鑒定參與ABA合成和降解過程的限速酶9–順式–環氧類胡蘿卜素加雙氧酶基因（NCED）、4 個細胞色素P450CYP70A基因，轉錄組分析表明在CATAS93-114 中，NCED和ABA2表達量較高，CYP707A1表達量較低，與Rek‐en501 低溫敏感品種相比，CATAS93-114 抗性品種在低溫條件下積累了更多的ABA。表明橡膠樹ABA依賴的信號途徑方面，低溫誘導橡膠樹內源ABA積累，然而在不同抗性橡膠樹品種中表現出差異：抗性品種ABA 合成關鍵酶基因ABA2表達高，降解酶CYP707A1基因表達表達較低；而在低溫敏感品種中則相反。因而在抗寒橡膠樹品種中，內源ABA含量較高。ABA 不依賴信號途徑基因表達，在不同抗性橡膠樹品種間未表現出表達差異。因此，ABA信號途徑決定了橡膠樹抗寒能力的差異。據此筆者推測，ABA 處理后橡膠樹熱研73397 組培苗后產生了脅迫導致體內ROS平衡破壞進而激活植物體內ABA 依賴性途徑的防御機制，啟動ROS 清除系統和調動體內能量合成相關基因抵抗脅迫。與之相反，120 μmol/L ABA 處理后橡膠樹熱研917 組培苗后并未使其產生脅迫，植物體內不需要調動能量合成相關基因和ROS 清除系統關鍵酶基因表達。熱研917 品種比熱研73397 抗逆能力強。因此，在橡膠樹栽培技術研發中，應針對不同抗性品種特性調整增產素和抗寒劑成分組成。

3.2 結論

120 μmol/L ABA 處理中抗品種熱研73397 和高抗品種熱研917組培苗葉片后，定位于線粒體和葉綠體相關基因、能量和蛋白合成相關基因和ROS清除系統關鍵酶基因受ABA 差異調控。熱研73397 品種顯著上調表達，熱研917葉片中的能量合成相關基因和ROS清除系統關鍵酶基因整體下調表達。應針對不同抗性品種特性調整增產素和抗寒劑成分組成。