玉露花莖誘導的2種愈傷組織細胞學及分化研究

張青華 王微 陳鵬 謝文申 張應華

(1 云南農業大學園林園藝學院 云南昆明 650201;2 北京擎科生物科技有限公司昆明分公司 云南昆明 650051;3 云南農業大學香料中心 云南昆明 650201;4 云南農業大學云南省滇臺特色農業產業化工程研究中心 云南昆明 650201)

玉露（Haworthia cooperi）為百合科十二卷屬多年生肉質草本植物，是軟葉品種，原產于南非，現世界多地均有栽植，因其透亮如露珠的外形而深受歡迎，市場需求較大［1-2］。玉露傳統的繁殖方法主要有分株、葉插、莖插、播種［1］等。傳統繁殖方法存在繁殖周期長、效率低的問題。近年來組織培養因其繁殖速度快、成苗量大而逐漸成為玉露種苗生產的一種重要方法。現階段對玉露組織培養的研究主要集中在外植體的選用、快繁建立、增殖、生根階段激素的配比等方面，如外植體主要用花莖和葉片，激素主要用生長素（NAA、IAA、IBA AC）和細胞分裂素（KT、6-BA）搭配［3-5］。以上相關研究促進了玉露組培技術的發展，但是還存在諸多問題，一些品種存在快繁的瓶頸問題，如繁殖率低、玻璃化和褐化等，至今仍然沒有得到很好的解決［5］。為解決這一系列問題，了解植株再生過程中愈傷組織的分化情況很有必要。愈傷組織器官形成方式有不定芽發生和胚狀體發生兩種，離體培養中植株以體細胞胚的方式再生在園藝植物中較為常見［6］，植物體細胞胚再生方式具有普遍發生、遺傳穩定、適于作為外源基因轉化受體系統等優點［7］。目前，對玉露愈傷組織的研究較少，嚴小峰等［8］對誘導玉露胚性愈傷組織的激素配比進行研究，但判定胚性愈傷組織僅憑眼睛觀察；朱潔瓊等［9］對冰燈玉露的體細胞胚形態學、解剖學進行研究，但是沒有愈傷組織分化過程的形態學、細胞學研究。本研究對玉露體細胞誘導的愈傷組織以及愈傷組織的分化做了形態學，細胞學方面的探討，以期明確玉露愈傷組織分化的途徑及不同分化途徑的區別，為優化十二卷屬觀賞植物離體快繁技術體系以及新品種創造提供一定的技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試材

玉露花莖來源于溫室栽培。

1.1.2 試劑

蒸餾水，75% 酒精，0.1% HgCl2，10% NaClO，MS 培養基，NAA，6-BA，蔗糖，谷氨酰胺，水解酪蛋白，碘化鉀，玻片等。

1.2 方法

1.2.1 試驗體系的建立

1.2.1.1 材料處理

于2017 年3 月中旬取溫室栽培的玉露花莖，長10～20 cm，在自來水下沖洗，除去花莖表面灰塵、花粉等雜物；沖洗好后剪成合適長度，用蒸餾水浸泡攪拌2 min；將處理好的花莖放入75%的酒精中消毒30 s，接著用0.1% HgCl2消毒5 min，10%NaClO 消毒4 min。以上每項處理之后，均用無菌水沖洗5次。

1.2.1.2 愈傷組織誘導

將滅菌后的每個花莖用吸水紙吸干表面水分，然后剪成1～1.5 cm 的莖段，將其接種在MS+0.2 mg/L NAA+1.5 mg/L 6-BA+3%蔗糖、pH 5.8 的固體培養基上進行暗培養，培養溫度為21～23℃。

1.2.1.3 繼代培養

將獲得的愈傷組織進行繼代培養，培養基配方為MS+0.2 mg/L NAA +1.5 mg/L 6-BA+3%蔗糖+100 mg/L 谷氨酰胺+250 mg/L 水解酪蛋白。轉接愈傷組織時，去掉外植體，小心地將愈傷組織成塊轉接。培養溫度21～23℃，光照強度為2 200 lx，12 h/d，培養25 d 之后繼續繼代，直至愈傷組織分化。

1.2.2 玉露胚性愈傷組織細胞學的鑒定

1.2.2.1 1%碘化鉀溶液的配制

稱取8 g 碘化鉀溶于100 mL 蒸餾水中，待全部溶解后，加入1 g 的碘，振蕩，完全溶解后保存在棕色瓶內。

1.2.2.2 淀粉染色觀察

用潔凈紗布將載玻片和蓋玻片擦拭干凈，然后在載玻片中央滴一滴清水，用單面刀片切取一小塊愈傷組織，完全浸入水滴，將愈傷組織展平，蓋上蓋玻片，避免出現氣泡；在蓋玻片一側滴一滴1%碘化鉀溶液，用吸水紙從另一端吸引，使染液完全浸潤標本；靜置染色10～15 min 后用顯微鏡進行觀察記錄，拍照。

1.2.2.3 石蠟切片制作

石蠟切片采用常規的石蠟切片方法，采用鐵礬—蘇木精染色法。

2 結果與分析

2.1 玉露花莖誘導的愈傷組織繼代培養

玉露花莖外植體接種在培養基上10～15 d 后，上部分幼嫩位置的花莖開始膨大，初步誘導出緊密、淡綠色、質地較硬的塊狀愈傷組織（圖1-a）；經過2次繼代培養后，愈傷組織增殖并且形態發生改變，繼續培養，逐漸出現2種不同形態的愈傷組織，一種是松脆顆粒狀愈傷組織（圖1-b），另一種是結構較為松散，外表粗糙的愈傷組織（圖1-c）。

圖1 玉露花莖誘導出的愈傷組織

2.2 兩種愈傷組織外部形態鑒定結果

對2 種不同的愈傷組織進行外部形態學觀察。觀察結果顯示：A類愈傷組織外表呈顆粒狀（圖1-b），顏色為淡黃綠色，外表光滑，質地較硬；B 類愈傷組織外表呈團狀（圖1-c），顏色為黃白色，外表粗糙，質地綿軟。

2.3 兩種愈傷組織細胞觀察結果

對2種愈傷組織做細胞觀察。淀粉染色結果觀察發現，A 類愈傷組織染色的細胞較多，染色較深，單個細胞可觀察到明顯的淀粉顆粒（圖2-a）。B 類愈傷組織不能染色或僅在細胞周邊染色，難以觀察到明顯的淀粉顆粒（圖2-e）。石蠟切片觀察結果顯示，A 類愈傷組織可觀察到細胞較小、染色較深、細胞核明顯、排列整齊的細胞群（圖2-b、2-c）；有細胞核的單個細胞細胞核和核仁較大，細胞質染色明顯，說明胞質濃厚（圖2-d）。B類愈傷組織愈傷組織細胞大小不均勻，細胞排列松散且細胞形狀不規則，細胞核不明顯（圖2-f、2-g）；有細胞核的單個細胞中，細胞質未被染色，且細胞核較小（圖2-h）。初步判斷A類愈傷組織中細胞較小、染色較深、核仁較大、胞質濃厚的細胞群為胚性細胞。

2.4 兩種愈傷組織分化情況的細胞學觀察

將A、B兩類愈傷組織繼續繼代培養，A類愈傷組織保持顆粒狀增殖并開始分化，B 類愈傷組織增殖為塊狀、水漬狀愈傷組織，并逐步開始分化。A類和B 類愈傷組織的分化途徑明顯不同。A 類愈傷組織分化時在愈傷組織表面出現綠色半透明突起（圖3-a），從中能觀察到分化出的球形胚（圖3-b）、子葉形胚（圖3-c、3-d）；切片觀察顯示，綠色半透明突起為多個分化的胚性細胞團（圖3-e），正在分裂的胚性細胞團周圍的細胞為非胚性細胞，說明每一個分化的胚性細胞團相對獨立（圖2-b）；在分化的細胞團中能觀察到胚芽和胚柄（圖3-f），說明體細胞胚分化的雙極性；觀察到分化出的芽體型較小，形態較為完整（圖3-g）；繼續培養，成苗速度較快，再生苗變異小（圖3-h）。B類愈傷組織分化初期為綠色不規則突起，這些突起繼續分化形成單極器官芽，經繼續培養后以產生不定芽的方式繼續分化（圖3-i）；切片能觀察到不定芽的細胞分化，與胚性細胞相比，這些細胞保持較大和較為松散的形態進行分裂、分化（圖3-j），同時還觀察到幾個不定芽連在一起分化的情況（圖3-k）；分化出的不定芽形態不完整，大小差異大，繼續培養可以成苗（圖3-l）；后期培養發現成苗的速度慢，變異較為明顯。

2.5 兩種愈傷組織的判斷

圖2 兩種愈傷組織細胞觀察結果

根據Zimmerman 的體細胞胚發生理論［6］，體細胞胚發生于胚性細胞，其過程不產生與母體組織相聯系的維管組織，與植物合子胚的發育過程類似，具有兩極性的發生形式。在甘蔗、棉花等作物的胚性愈傷組織均發現有松脆顆粒狀結構、生長比較緩慢或排列較松散且易碎的外部形態學特征，胚性細胞具有細胞較小，細胞質的多胺、可溶性糖、淀粉含量較高，具有較大的細胞核和核仁，染色較深，呈圓形，細胞排列有序等特點［10-12］。胚性愈傷組織分化時，有成苗量大、速度快、芽結構完整的特點［12］。根據對玉露誘導的兩種愈傷組織細胞的觀察結果，以及愈傷組織分化的形態學和細胞學觀察結果，推測A類愈傷組織為體細胞誘導的胚性愈傷組織，這種愈傷組織的植株再生方式為體細胞胚胎發育方式，分化過程類似于合子胚的發育方式，再生植株來自于胚性愈傷組織中胚性細胞的分裂和分化。B 類愈傷組織為非胚性愈傷組織，再生植株來源于繼代培養后有分化能力的非胚性細胞分化的不定芽。胚性愈傷組織發生的再生植株較多，體型較小，每個芽彼此分離，眼睛可見有葉和莖部較為完整的植株器官，繼續培養生長較快，能有效避免玉露組織培養易變異的問題，并且保持較高的成苗率。非胚性愈傷組織通過不定芽的方式產生再生植株，植株往往最先分化出單極器官芽，分化時會出現幾個芽連在一起分化的情況，繼續培養能夠成為再生植株，但生長分化速度慢，芽變異較為明顯。

圖3 兩種愈傷組織的分化觀察

3 討論與結論

觀賞型植物胚性愈傷組織可通過不同的外植體誘導得到，如種子（多花薔薇）［13］、葉柄（百合）［14］、花絲（白姜花）［15］，下胚軸、子葉、莖段（白刺花）［16］。本研究使用玉露花莖為外植體，經過脫分化誘導出胚性愈傷組織和非胚性愈傷組織，經觀察發現胚性愈傷組織細胞核大、細胞質濃密、排列緊密；非胚性愈傷組織細胞呈不規則排列，分布較松散，細胞間隙較大，為無明顯細胞核結構的細長或大的高度液泡化的大型薄壁細胞團，這與朱潔瓊等［9］以冰燈玉露葉片為外植體誘導的愈傷組織結果一致，說明玉露外植體脫分化產生的愈傷組織中同時存在胚性愈傷組織和非胚性愈傷組織，其中胚性愈傷組織發生較為普遍。在胚性愈傷組織的分化過程中，觀察到了球形胚、子葉形胚，說明胚性愈傷組織的分化是按照體細胞胚胎的發育過程進行的，這樣可確保再生植株的遺傳穩定性。在植物生長調節劑使用上，本研究使用NAA 和6-BA，嚴小峰等［8］使用6-BA 和2，4-D，朱潔瓊等［9］使用6-BA 和IAA，多種生長素類物質均能誘導玉露產生胚性愈傷組織。

體細胞胚胎的再生方式相對于器官發生具有再生率高、速度快、數量多等優點，是觀賞植物大規模繁殖的一種重要方式。本研究將玉露花莖誘導的愈傷組織進行繼代培養，對繼代及分化過程中出現的2種愈傷組織外形和細胞進行觀察，發現一種為胚性愈傷組織，另一種為非性愈傷組織。胚性愈傷組織以體細胞胚胎發育方式進行分化，能觀察到球形胚、子葉形胚的發育階段，符合單子葉植物合子胚發育過程；繼續培養后發現此方式分化的無菌苗變異小、生長快。非胚性愈傷組織以器官發生方式進行分化，大部分是先形成芽，再形成完整植株，分化過程慢，易變異。雖然玉露胚性愈傷組織和非胚性愈傷組織均能分化出再生植株，但通過胚狀體途徑分化可以有效地解決組培苗變異大、玻璃化、生長緩慢等問題。本研究結果可優化十二卷屬觀賞植物離體快繁技術體系，進一步為新品種創造提供一定的技術支撐。