海南桑樹栽培品種桑葉中1-脫氧野尻含量的測定

何際嬋 董志超

(中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所 海南海口 571737)

桑葉為桑科（Moraceae）植物桑（Morus alba L.）的葉，具有疏風清熱、平肝明目的功效［1］。現代藥理研究表明，桑葉中含有多種羥基生物堿，其中以1-脫氧野尻霉素（DNJ）為代表的多羥基生物堿是桑葉中重要的降血糖成分［2-3］。DNJ 是從桑樹中發現的一種天然哌啶生物堿，它可競爭性地抑制小腸粘膜上的ɑ-糖苷酶的活性，減緩葡萄糖的吸收速率，降低餐后血糖濃度，從而發揮治療糖尿病的作用［4-5］。但桑葉的DNJ 含量受桑樹品種、生長環境、桑葉部位等影響較大［6］。任立松等［7］為探明東北地區不同桑樹品種間1-脫氧野尻霉素含量的差異，對10 個現行品種葉片中的DNJ含量進行了測定，結果表明不同品種間DNJ 含量存在一定的差異。禚蘇等［8］安康地區具有代表性的24 個桑樹栽培品種桑葉為原材料，運用反相高效液相色潽法測定各品種春季桑葉中1-脫氧野尻霉素的含量，結果表明，安康地區桑樹品種中桑葉DNJ 含量具有顯著差異。

近幾年，在“東桑西移”“北桑南移”的結構性區域調整下，海南的蠶桑產業迅速發展［9］，并建立了桑樹種質資源圃。

但目前尚未見有關海南種植桑葉品種DNJ含量測定的報道。DNJ 因其結構中缺少發色團，所以很難采用HPLC 法直接測定。目前，桑葉中DNJ 的檢測多采用HPLC-ELSD法［10］、HPLC-FLU法［11］、HPLCMS法［12］和柱前衍生化HPLC-UV法［13］等。本研究運用柱前衍生化HPLC-UV 法對海南省目前種植的31個桑樹品種桑葉進行DNJ含量測定，為桑葉在海南的進一步開發利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試材

供試材料為海南創科農旅集團桑樹種質資源圃中栽植的海南省主要桑種品種，包括粵桑11號、黑珍珠、日本甜桑、胖果桑、強桑2號、大十、紅果2 號、紅果5 號、抗青283、桂桑優62、桂桑6號、農桑14號、新西蘭垂桑、新西蘭九曲龍桑等，共31 個品種。于2020 年6 月，取桑枝頂自下7、8 片葉，于50℃烘干至恒重，將以上樣品粉碎后過60目篩，備用。

1.1.2 儀器

Agilent1260 高效液相色譜儀（G1329A 自動控溫進樣器，G1311A 四元泵，G1316A 柱溫箱；美國安捷倫公司）；電子天平（BSA224S—CW；賽多利斯科學儀器有限公司）；高功率數控超聲波清洗器（KQ－700DA 型；江蘇昆山）；高速冷凍離心機（Thermo Fisfer）；GZX－9240MBE型電熱鼓風干燥箱（上海博迅實業有限公司醫療設備廠）。

1.1.3 試劑

1-脫氧野尻霉素標準品（純度≥98%，10027491），美國麥克林公司；9-氯甲酸芴甲酯（FMOC-CL，純度＞98%，C10074878），美國麥克林公司；乙腈（色譜純，178508），德國默克公司；氯化鉀、硼酸、氫氧化鈉（分析純，北京化工廠）；水為雙重蒸餾水。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件

參考鄭曉靜等［14］的方法，并略有改動。色譜柱：Waters C18 （4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.1% 醋酸（35∶65，V/V）；流速：1.00 mL/min；柱溫： 30 ℃；檢測波長：254 nm；進樣量：10 μL。

1.2.2 對照品與供試品溶液的制備

精密稱取DNJ 對照品10 mg，用甲醇溶解，定容至10 mL，搖勻，得1.0 mg/mL對照品溶液，置冰箱備用。

精密稱取供試桑葉粉0.5 g 于15 mL 離心管中，加入6 mL 50%乙醇水溶液，超聲提取30 min（溫度50℃，功率200 W）；以5 000 r/min 離心30 min，收集上清液，重復提取3次，合并3次提取液。

1.2.3 DNJ的衍生化

桑葉供試品溶液及DNJ對照品溶液的衍生化反應參照文獻［14］。

2 結果與分析

2.1 線性關系考察

分別精密吸取對照品溶液1.0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 μL，依照上述色譜條件測定。以峰面積作為縱坐標，以濃度作為橫坐標，進行線性回歸，回歸方程為：y=47 820.489x+247.586 82 （r=0.994 9，n=5）。結果表明，DNJ 在0.308～12.622 μg 呈現良好的線性關系。HPLC圖譜見圖1。

2.2 精密度試驗

精密吸取同一份供試液，連續進樣5次，每次進樣10 μL，計算峰面積得RSD=1.08%。

2.3 穩定性實驗

取同一份桑葉的供試品溶液，分別在第1、3、5、8、10、12 h 進樣，每次進樣10 μL，按上述色譜條件測定，測定峰面積，計算得RSD=0.89%（n=6），結果顯示，該溶液在12 h內穩定。

2.4 重現性實驗

依照供試品溶液制備方法平行制備5 份強桑2號桑葉供試品溶液，分別進樣10 μL，測定峰面積，計算得RSD=1.45%（n=5），結果顯示，該方法具有較好的重現性。

圖1 1-脫氧野尻霉素對照品（A）和樣品（B）的HPLC色譜圖

2.5 加樣回收率實驗

稱取6份已知含量的強桑2號粉末各0.1 g，分別加入DNJ 對照品溶液，按“1.2.2”方法制備溶液，再按上述色譜條件測定含量，計算回收率。結果得平均回收率為99.5%，RSD=1.90%（n=6），表明本測試方法符合加樣回收率的要求，結果見表1。

表1 DNJ的加樣回收率

2.6 方法檢測限及定量限的確定

方法檢測限、定量限是通過所測得色譜峰的信噪比（S/N）來確定。S/N=3 對應的標準溶液濃度為該方法的檢測限；S/N=10對應的標準溶液濃度為該方法的定量限。通過柱前衍生化HPLC-UV法測定不斷稀釋的DNJ標準溶液，得到該方法的檢測限和定量限分別為0.23、0.65 μg/mL。

2.7 樣品測定

按“1.2.2”方法制備3 份樣品，再分別進行樣品測定，結果見表2。海南栽培的31個桑樹品種中，有3 個桑樹品種的DNJ 含量在3.00 mg/g 以上，即強桑2 號、大十、大白珍珠；其中DNJ 含量最高的是強桑2 號，為3.68 mg/g，其次為大十、大白珍珠，分別為3.23、3.15 mg/g；有7 個桑樹品種的DNJ 質量分數均在2.00～3.00 mg/g：抗青283、桂桑優62、日本甜桑、胖果桑、強桑3 號、油桑和陜860；有19個桑樹品種的DNJ質量分數均在1.00～2.00 mg/g。而黑珍珠桑、桂芒桑、紅果5 號等桑葉品種DNJ含量較低，分別為0.62、0.88、0.96 mg/g。

3 討論

結果表明，不同品種DNJ 含量的變化較大，DNJ 含量3.68～0.62 mg/g，其中強桑2 號中DNJ 含量最高，為3.68 mg/g；黑珍珠桑DNJ 含量最低（0.62 mg/g）；強桑2號中DNJ含量是黑珍珠桑的5.93倍。說明不同桑樹品種產生的DNJ 有差異，為選育高DNJ 含量的桑樹品種奠定基礎。強桑2 號不但DNJ 含量最高，且葉片肥大，可以作為DNJ類的藥食產品開發原材料。

鄭曉靜等［14］用RP-HPLC 方法對桑葉中的DNJ 含量進行了測定，該方法最大的特點是沒有加入甘氨酸和0.1%的醋酸終止DNJ 的衍生化反應。從本實驗借鑒該方法的精密度、穩定性、重現性及回收率的測定結果來看，只要在12 h 內完成檢測，即表明該方法穩定可靠且更簡便。

表2 不同品種桑葉中DNJ的含量

本實驗考查了酸水、去離子水、稀醇3種溶劑對DNJ 提取率的影響，結果表明稀醇提取的DNJ 含量最高，最終選擇稀醇作為提取溶劑。

有文獻報道稱，DNJ 的日服用有效劑量至少為6 mg，才能起到預防或治療糖尿病的目的，而桑葉中DNJ 的含量偏低，如何有效提高桑葉中DNJ 的含量將是未來一段時間內桑葉研究的方向之一。