不同生長年限獨一味的形態組織學研究

鮑 新，劉 琴，古 銳，鐘世紅，2

（1.成都醫學院藥學院，成都 610500；2.西南民族大學藥學院，成都 610200；3.成都中醫藥大學民族醫藥學院，成都 610075）

獨一味來源于唇形科獨一味屬植物獨一味［Lamiophlomis rotata（Benth.）Kudo］，是歷史悠久的藏族常用藥材，具有活血止血、祛風止痛的功效，廣泛用于治跌打損傷、外傷出血、風濕痹痛等癥［1，2］。近年來，獨一味止痛效果良好且無成癮性的優勢，引起了業界的廣泛關注，以獨一味為主要原料的成方制劑及下游產品的開發日益增多。逐年增長的藥用需求，導致其連年過度采挖，加之生態環境不斷退化，獨一味藥材資源日益減少，于2000 年被列為一級瀕危藏藥品種［3，4］。由于獨一味尚未實現規?；N植，商品全部來源于野生資源，因此研究獨一味種群特征，進而開展規?；N植已迫在眉睫。

種群中各年齡期個體數在種群中所占的比例是種群的年齡結構［5］，植物種群年齡結構的確定，是分析種群結構特征、分布格局、演替規律的重要前提，可以解釋個體、種群與生境的相互關系。植株齡級的判斷是研究種群年齡結構的基礎［6，7］，且其生長年限的確定也與藥材的品質息息相關［8］。與木本植物可通過其年輪的環數確定年齡不同［9-11］，草本植物在形態結構上未見如此普及的鑒別特征，僅局限于禾本科、莎草科等植物依據分蘗類型判斷植株年齡［12，13］。多年生草本植物齡級劃分的困難，導致草本植物種群特征研究相對不足。近年來，一些多年生草本植物已陸續報道具有生長輪構造［14，15］。包括藥用植物中的類似生長輪構造，如人參［16］、芍藥［17］和川續斷［18］可在主根觀察生長輪，黃芩［19］根木質部導管的排列方式可作為其生長年限辨別依據。然而，并非所有的多年生草本植物都具有生長輪構造，有的植物生長輪構造僅在部分產地植株中出現［20］，多年生草本植物的年齡確定相對較為困難。

本研究采集1～3 年生栽培獨一味植株，觀察并比較了不同生長年限獨一味的外觀性狀和顯微構造，初步獲得了不同生長年限獨一味的形態組織學鑒別特征。為驗證結果，亦采集野外不同大小等級的獨一味進行觀測，來源于同一樣地的小、中、大等級野生獨一味植株表現出類似1～3 年生栽培獨一味的形態組織學特征差異。研究結果可為獨一味種群年齡結構研究、種群動態預測提供參考，進而為合理利用、保護野生獨一味資源提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

于2016 年9 月至2018 年9 月，在四川省阿壩州若爾蓋縣熱爾大草地收集野生獨一味種子，播撒于四川省阿壩州茂縣三龍鄉進行栽培種植，于2020 年5 月采集1～3 年生獨一味植株各15 株。2020 年9 月在四川省甘孜州稻城縣采集未知年限的小、中、大3組獨一味樣品各15 株，經西南民族大學藥學院鐘世紅教授鑒定為唇形科植物獨一味。

1.2 儀器與試劑

10000XL 根系分析掃描儀（日本EPSON 公司，WinRHIZO 分析系統）；BX41 和BX63 正置熒光生物顯微鏡（日本OLYMPUS 公司）；SMZ168 體式顯微鏡（中國Motic 公司）；TK-218 型自動輪轉切片機（德國Leica 公司）；B7126-A 型包埋機（德國Leica 公司）；番紅O-固綠植物組織染色液（上海源葉生物科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 測量性狀特征 獨一味新鮮植株用去離子水洗凈后濾紙吸干水分，電子分析天平分別稱量獨一味地上部分和地下部分鮮重；用坐標紙測定葉片長度和寬度；采用根系掃描儀掃描獨一味根系，保存圖片后運用WinRHIZO 2009 根系系統分析軟件分析總根長、總根表面積、總根體積、主根長、主根表面積、主根體積、主根直徑及根尖數等指標。

1.3.2 石蠟切片的制備 取新鮮1～3 年生栽培獨一味與未知生長年限小、中、大等級野生獨一味各15株，放入FAA 固定液中固定后，梯度乙醇脫水、梯度二甲苯透明、浸蠟、包埋、切片（厚度為8 μm），番紅O-固綠染色，封片，分別制成葉橫切片與根橫切片，置于生物顯微鏡下觀察與拍照。

1.3.3 徒手切片的制備 撕取獨一味下表皮，稀甘油裝片，取任意清晰可見的視野置于顯微鏡下觀察與拍照，每張裝片觀察3 個視野，觀察氣孔、腺鱗的形態與數目，計算腺鱗密度［單位面積內腺鱗的個數（個/mm2）］和氣孔指數［氣孔指數=100×氣孔個數/（氣孔個數+表皮細胞個數）］。

1.4 數據處理

采用SPSS 19.0 軟件進行數據處理與分析，使用ANOVA 和Duncan’s 法對試驗數據進行差異性分析。所有指標的數據均以15 個生物重復的平均值±標準誤差（±s）表示。

2 結果與分析

2.1 不同生長年限栽培與野生獨一味外觀性狀

獨一味為多年生草本；貼地生長；葉對生，4～6枚，多為菱狀圓形，基部下延至葉柄，邊緣具圓齒，葉表面皺縮，具短柔毛。一年生獨一味主根細長，無分枝，須根較少；二年生獨一味主根分枝0～2 個，須根較多；三年生獨一味主根粗大，偶見剝落的栓皮，較粗的根偶見枯心，根中部及下部出現分枝2～5 個，須根茂密（圖1）。

圖1 栽培獨一味

由表1 可以看出，栽培獨一味鮮重、根重、株高、葉長、葉寬、葉面積、根表面積、根體積、主根表面積、主根體積及主根直徑等隨著年限的增加均呈上升趨勢且有顯著差異（P＜0.05）。說明1～3 年均為獨一味的快速生長期。不同生長年限栽培獨一味的生物量積累趨勢存在差異，一年生根冠比為0.50，二年生根冠比為0.52，三年生為0.40，結合地上、地下生物量隨著生長年限呈上升趨勢，說明獨一味幼苗最初的2 年地上、地下部分增長接近，從第3 年開始，地上部分增長更為迅速。

表1 不同生長年限栽培獨一味生物量比較（±s，n=15）

表1 不同生長年限栽培獨一味生物量比較（±s，n=15）

注：“*”為差異顯著（P<0.05），“**”為差異極顯著（P<0.01）；表2同

指標 一年生 三年生二年生全株鮮重//g地上部分鮮重//g地下部分鮮重//g根冠比葉片總面積//cm2葉片總長//cm葉片總寬//cm代表葉片面積//cm2代表葉片長//cm代表葉片寬//cm總根長//cm總根表面積//cm2總根體積//cm3主根長//cm主根表面積//cm2主根體積//cm3主根直徑//cm根尖數//個0.36±0.24 0.25±0.17 0.12±0.07 0.50±0.20 6.77±5.29 7.95±1.94 4.95±1.83 2.45±1.78 2.45±0.67 1.50±0.49 121.40±87.99 11.34±7.13 0.09±0.05 13.25±2.08 3.47±0.79 0.08±0.04 0.85±0.28 561.13±265.79 8.99±5.10**6.57±3.98**2.40±1.18**0.40±0.08 94.93±56.15**27.76±8.38**25.13±9.03**35.54±15.02**7.23±1.10**6.42±1.85**248.53±19.57*52.12±22.65**1.01±0.45**15.98±3.42*14.09±4.06**0.99±0.43**2.80±0.45**706.00±409.74 2.59±0.71*1.73±0.53 0.86±0.23**0.52±0.13 33.63±7.95*17.17±4.27**12.73±3.30**11.97±2.49**4.93±0.52**3.60±0.47**253.98±143.60*36.67±13.97**0.46±0.14**14.42±4.38 7.92±2.42**0.36±0.14**1.76±0.31**687.00±383.94

未知年限的野生獨一味外觀性狀與人工栽培獨一味性狀呈相似規律，無論是地上部分還是地下部分生物量均出現增大趨勢。隨著植株的增大，根愈發粗壯且栓皮脫落，分枝逐漸增多，根部枯朽加重（圖2）。

圖2 野生獨一味

2.2 不同生長年限栽培與野生獨一味顯微特征

2.2.1 葉片下表皮 栽培獨一味的下表皮細胞垂周壁平直或微彎曲，氣孔多為不定式或不等式，可見腺鱗，腺頭多為4 細胞（圖3）。由表2 可以看出，隨著年限的增加，腺鱗密度減少且有極顯著差異（P<0.01），氣孔指數無明顯變化。

野生獨一味的下表皮氣孔、腺鱗和表皮細胞形態相似，不同大小等級的植株特征無明顯變化（圖4）。

2.2.2 葉橫切面 栽培獨一味葉上、下表皮細胞各1 列，外被角質層，偶見非腺毛和腺鱗。柵欄組織排列緊密，多為2～3 列；海綿組織排列疏松，不過中脈。中脈維管束為外韌型，“U”形排列。1～3 年生獨一味下表皮內側均為2～3 列厚角組織；一年生獨一味上表皮內側未發現厚角組織；二年生獨一味上表皮內側偶見厚角組織1～2 列；三年生獨一味上表皮內側厚角組織2～3 列。一年生獨一味葉中脈維管束1個，木質部導管十幾個聚集呈團狀排列；二年生獨一味葉中脈維管束1～2 個，木質部導管數十個聚集呈環狀排列；三年生獨一味葉中脈維管束1～3 個，木質部導管數十個聚集呈環狀排列（圖5）。

圖3 栽培獨一味葉下表皮（×400）

圖4 野生獨一味葉下表皮（×400）

結合表2 可知，隨著年限的增加，中脈逐漸膨大，葉片厚度逐漸增加且有極顯著差異（P<0.01），上、下表皮變化不顯著。

野生獨一味葉橫切面內部結構與栽培獨一味相似。小株獨一味中脈維管束1～2 個，上、下表皮內側厚角組織2～3 列；中級大小獨一味中脈維管束1～3個，上、下表皮厚角組織3～5 列；大株野生獨一味中脈維管束1～4 個，上、下表皮內側厚角組織4～5 列（圖6）。

圖5 栽培獨一味葉橫切面

圖6 野生獨一味葉橫切面

表2 不同生長年限栽培獨一味葉片指標比較（x±s，n=15）

2.3 根橫切面

栽培獨一味根木栓層由1～2 列細胞組成，呈深棕色；韌皮部細胞排列較緊密，形成層明顯，呈環狀，木質部寬廣，不同生長年限栽培獨一味根導管排列方式不同。1～2 年生根導管單個散在或數個成束，呈扁平層狀排列，一年生根導管排列緊密，二年生根導管排列較稀疏；三年生根導管數十個成束切向連續排列成與環狀結構（圖7）。

圖7 栽培獨一味根橫切面

野生獨一味根部顯微結構與栽培獨一味相似，隨著植株的增大，枯朽逐漸加重。小株獨一味根中部細胞排列緊密，導管數十個成束切向連續排列成環狀結構；中級大小獨一味根中央部位具多輪木栓細胞環，其內側薄壁細胞消失，有較大裂隙，各木栓細胞環層之間導管亦呈斷續環狀分布；大株獨一味根中部亦出現木栓細胞環，其內側枯朽嚴重，呈較大空洞（圖8）。

圖8 野生獨一味根橫切面

3 小結與討論

本研究對1～3 年生栽培獨一味從外觀性狀和組織構造進行了比較研究，不同生長年限的獨一味表現出一定的差異。為了進一步驗證，亦采集野生獨一味進行觀察，雖不能確定野生植株具體生長年限，但基于前期多年持續的野外觀察數據，葉片大小與齡級大小呈正相關趨勢，因此觀察來源于同一野生樣地小、中、大3 種大小級別的植株，獲得野生獨一味植株不同生長年限的特征趨勢。觀察結果表明，同一野生樣地小、中、大3 種大小級別的獨一味植株，具有類似栽培1～3 年生樣品的特征規律。

性狀特征比較顯示，隨著生長年限的增加，栽培獨一味出現分枝，二年生獨一味分枝0～2 個，三年生獨一味分枝2～5 個，且主根粗大，部分較粗的主根出現裂隙、枯心現象，偶見剝落的栓皮，須根較繁茂。而1～2 年生獨一味根未見枯心和剝落的栓皮，可據外部性狀初步判斷三年生獨一味。不同大小等級野生獨一味外觀性狀出現類似栽培1～3 年生栽培樣品的特征規律，隨著植株的增大，主根出現裂痕，且栓皮剝落程度、中部枯朽現象逐漸加重。

顯微組織觀察顯示，三年生栽培獨一味葉中脈維管束較發達，可達3 個，呈“U”形排列，而一年生葉的中脈維管束僅1 個；二年生葉的中脈維管束1～2個；三年生獨一味葉中脈上下表皮以下均可見厚角組織2～3 列，一年生葉中脈上表皮以下未見厚角組織，二年生葉的中脈上表皮以下偶見厚角組織1～2列。三年生獨一味根木質部導管數較多，數十個成束切向連續排列成環狀結構，而一年生根和二年生根導管單個散在或數個成束，未形成較連續的環狀結構。顯微組織方面可以從葉“U”形排列的中脈維管束，中脈上下表皮以內的厚角組織，根環狀排列的木質部導管判斷三年生獨一味。

野生獨一味葉中脈維管束和厚角組織的發達程度與植株的大小呈正比，與上述栽培獨一味規律相似。不同大小等級野生獨一味根內部結構生長規律類似栽培1～3 年生樣品的特征規律，小株獨一味根中心細胞排列緊密，木質部導管數十個成束切向連續排列成環狀結構；中等大小獨一味根中心開始出現栓化，中部木栓層含有導管與木質部導管呈平行環狀；大株獨一味根中心出現較大空洞，中部木栓層與外部木栓層呈同心環狀。

獨一味為多年生高原草本植物，但目前僅能采集可確定栽培年限的1～3 年生獨一味植株進行試驗。課題組亦采集了不同產地的野生獨一味植株進行形態組織學觀察，尤其仔細觀察了粗壯的大型植株，表現出主根粗壯、枝根數量多、須根繁茂、主根橫切面多有不同程度枯心的性狀特征；在根的顯微構造上導管聚集明顯，切向排列成多輪斷續的扁平帶狀。隨著生長年限的增長，獨一味是否體現出類似生長輪的構造，課題組將持續開展研究。

試驗試圖從次生代謝產物積累角度，尋找不同生長年限的獨一味植株差異。獨一味地上部分主要含有環烯醚萜類、苯乙醇苷類、酚酸類及黃酮類成分，地下部分主要含有環烯醚萜類和苯乙醇苷類成分。測定結果表明，無論是1～3 年生栽培獨一味樣品，還是不同大小等級野生獨一味樣品，其次生代謝產物含量均無顯著差異，即從次生代謝產物積累的角度暫未發現規律。