探討DNA 條形碼對搖蚊屬物種界定的有效性

余海軍，王 茜

（天津農學院水產學院/天津市水生生態及養殖重點實驗室，天津 300384）

搖蚊屬（Chironomus）隸屬于雙翅目搖蚊亞科（Diptera：Chironomidae），該屬由德國昆蟲學家Mei?gen 于1803 年建立，迄今為止全世界已記錄種類達303 種；搖蚊屬的幼蟲可以生存于各種水體（尚未污染至嚴重污染的水體），其中寬葉搖蚊亞屬（Lobochi?ronomus）在缺乏營養的水體中較為豐富，并且能耐受酸性環境，另一些搖蚊亞屬喜歡生長在鹽分較高的環境中，對重金屬污染具有耐受性［1］。搖蚊屬部分種類雄成蟲能引起人類過敏性疾病；裸露在外和正在產卵的搖蚊屬種類可以成為新鮮水體中魚類（鱒魚）的主要食物來源；在日常生活中，某些垂釣者所用誘餌也為搖蚊屬幼蟲［2］。

搖蚊屬是搖蚊科最古老的屬之一，由于種種歷史原因，該屬的研究在世界上一直存在很大的爭議，屬內物種的分類地位至今沒有獲得廣泛的認可。依據中國搖蚊名錄中統計，中國已有該屬種類共23種，其中只有13種具有明確記錄，另包括3種可疑種和7種只進行鑒定而沒有正式發表的［3］。因此，搖蚊屬的物種界定一直存在爭議［3］。隨著DNA 條形碼的提出，其通過將基因組的標準部分提取一個或幾個相對較短的基因序列，用于識別物種［4，5］；雖然使用DNA序列識別生物并不新穎［6］，但DNA 條形碼能快速且可靠地識別所有生命形式的物種層次，包括動物、植物、真菌、微生物；其在論證物種群落組成、食物鏈和種內遺傳變異方面也有所研究［7-9］；同時也扮演著生物安全和淡水生態監測中一個不可缺少的角色［10-13］。Lin 等［14］使用DNA 條形碼對長跗搖蚊屬（Tanytarsus）121 個形態種進行物種鑒定有效性分析，結果表明DNA 條形碼明確區分出94.6%的先前通過形態學研究分類的長跗搖蚊屬物種；Song 等［15］使用DNA 條形碼對多足搖蚊屬（Polypedilum）161 個形態種進行物種鑒定有效性分析，結果表明現已有研究中多足搖蚊屬94.4%的種類能有效被DNA 條形碼區分。

本研究基于編碼細胞色素C 氧化酶甲基I（COI）基因對搖蚊屬157 種的749 條DNA 條形碼進行分析研究，并利用相關軟件對搖蚊屬類群進行了遺傳距離和系統發育樹的分析，目的是探索DNA 條形碼在搖蚊屬物種界定方面的有效性，同時為完善搖蚊科DNA 條形碼數據庫提供參考，以填補當前國內該屬的研究空白。

1 材料與方法

1.1 分類抽取和收集信息

研究中695 條DNA 條形碼數據為BOID 和Gen?bank 數據庫提供，54 條為收集樣本，采集于新疆、寧夏、海南、貴州、廣西、天津、浙江等地；采集方式包括燈誘、馬氏網、D 型網、掃網；將采集后的幼蟲樣本保存于95%乙醇中，成蟲樣本保存于85%乙醇中，并存于4 ℃冰箱，用于后續的形態學和分子學研究。

1.2 DNA 提取和PCR 擴增

本研究通過Qiagen DNA Blood and Tissue kit 試劑盒，采用搖蚊成蟲的頭、胸部和幼蟲的腹部提取基因組DNA。提取后成蟲的頭、胸部保存到與翅、足和觸角一致的玻片標本上，用Euparal 樹膠封片，憑證標本均存于天津農學院水產遺傳育種實驗室。

使用通用引物LCO1490和HCO2198擴增COI條形碼［16］。PCR 擴增反應體系為25 μL，包含12.5 μL 2×Es Taq MasterMix，上下游引物各0.625 μL，dd H2O 8.75 μL，DNA模板2.5 μL。通過Master Cycler Gradient進行擴增，擴增程序為98 ℃預變性10 s，94 ℃5 min，35個循環（94 ℃1 min，51 ℃1 min，72 ℃1 min），最后72 ℃延伸5 min；10 ℃保存。PCR 擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送北京六合華大基因科技股份有限公司進行純化測序。

1.3 序列分析和對比

各個基因片段都采用雙向測序，根據測序公司返回的測序結果，使用軟件SeqMan 7.1.0.44 觀察峰圖質量編輯序列［17］。將編輯好的FASTA 文件導入MEGA7.0 后選擇標準密碼子進行后續密碼子比對。

用MEGA7.0 軟件分析對比后，對各樣本堿基的組成、簡約信息位點、變異位點（Variable sites）、保守位點、自裔位點、平均堿基含量、遺傳距離和堿基轉換與顛換比值進行統計。選用Kimura-2-parameter（K2P）分子進化模型，節點處置信度為1 000，其他設置均為默認值，建立鄰接樹。

利用ABGD 軟件分析mOTU 的數量［18］：將編輯好的FASTA 文件在線提交到ABGD 網站（http：//ww?wabi.snv.jussieu.fr/public/abgd/），選擇K2P 模型，種內差異先驗值P 為0.001～0.100，相對gap 寬度值X 為1.0，其余參數設置為默認值［15］。本研究的54 條DNA 序列及其相關信息均已上傳BOLD（http：//www.boldsystems.org）數據庫。

2 結果與分析

2.1 序列特征

研究共獲得搖蚊屬749 條DNA 條形碼，其中實驗 室 獲 得54 條DNA 條 形 碼，695 條 來 自BOID 和Genbank 數據庫，所有序列的長度均為658 bp，各堿基的平均含量分別為A=26.56%，T=37.67%，C=18.82%，G=16.92%，序列存在堿基的偏倚性，C+G的含量顯著低于A+T 的含量，特別是第三核酸位點A+T 的含量為85.15%。通過比對序列得出，信息位點有244個，占37.08%；變異位點有261 個，占39.67%。大部分的變異位點都集中在第三核酸位點，其比例為78.16%，表明在第三核酸位點上的堿基進化速率快。

2.2 遺傳距離

在DNA 條形碼研究中，種內與種間遺傳距離的差異是一項非常重要的指標，當種間遺傳距離大于種內遺傳距離，就會形成一個明顯的空白區［15，19］。

實驗室共獲得54 條DNA 條形碼，形態鑒定約為12 種。結合BOID 和Genbank 數據庫已下載的數據，分析統計共獲得形態種約50 種。在MEGA 7.0軟件中，對所有形態種進行分組，即60 個組。種內遺傳距離為0～7.21%，平均值為1.10%；種間遺傳距離為0.2%～19.4%，平均值為14.25%；種間平均遺傳距離是種內平均遺傳距離的12.95 倍，因此本研究的749 條形碼數據存在明顯的空白區。

Hebert 等［5］通過對無脊椎動物及脊椎動物11門13 320 個物種進行了DNA 條形碼的研究，并提出了種間平均遺傳距離大于種內平均遺傳距離的10 倍作為區分物種的標準；隨著DNA 條形碼的深入研究，不同領域的學者對該標準進行了驗證，在搖蚊科不同類群中也出現了相應的研究，詳細結果見表1。

表1 搖蚊科不同類群遺傳距離比較

2.3 系統發育樹結果

本研究采用DNA 條形碼分析中最常用的鄰接法，基于54 條DNA 條形碼明顯分離出13 個分類操作單元，代表搖蚊亞科中12 個已命名的物種，結果顯示DNA 條形碼的鑒別結果與形態學鑒定結果一致（圖1）。

圖1 54 條DNA 條形碼鄰接樹

2.4 ABGD 評估結果

ABGD 在線軟件通過比較種內和種間的遺傳距離，當種間最小遺傳距離大于種內最大遺傳距離時則出現空白區，DNA 條形碼空白區的存在很容易將物種分開（圖2）。

圖2 749條DNA條形碼基于K2P模型得到的遺傳距離分類

基于ABGD 在線軟件評估搖蚊亞科OTUs 的數量，即通過設定不同的閾值P，得到不同的OTUs 數量；隨著P 增大，OTUs 的數量減少（圖3）。當P 為0.002 637 時，749 條DNA 條形碼被分為104 OTUs；P 為0.026 827 時，被分為61 OTUs。即OTUs 的置信區間可為61～104，ABGD 所評估的OTUs 的數量略大于形態評估的種類。當P 為0.037 276 時，被分為58 OTUs，最為接近鄰接樹法評估的分子操作單元數量，因此ABGD 方法評估749 條搖蚊亞科DNA條形碼的遺傳距離閾值為3%～4%。

圖3 ABGD 在線評估OTUs的數量隨P 的變化

3 討論

目前為止，DNA 條形碼技術存在5 種分析方法，即遺傳距離的分析、遺傳相似度的分析、系統發育樹的分析、序列特征的分析和統計分類法的分析［21］，而在搖蚊DNA 條形碼研究中，主要是基于遺傳距離和系統發育樹的分析［22-28］。

基于遺傳距離的分析，即通過計算DNA 條形碼序列的遺傳距離，從而實現物種的區分，主要分析方法包括DNA 條形碼間隙和遺傳距離閾值分析［21］。DNA 條形碼間隙的一項非常重要指標是種內與種間遺傳距離的差異，當種間遺傳距離大于種內遺傳距離，就會形成一個明顯的空白區。本研究中種內平均遺傳為距離為1.10%，種間平均遺傳距離為14.25%，后者大約是前者的12.95 倍，形成了空白區。遺傳距離閾值是指物種在能形成空白區的前提下，使用物種種間遺傳距離與參比的遺傳距離閾值進行對比，當種間遺傳距離大于參比的閾值，則可以將物種區分為不同物種。閾值法在DNA 條形碼的物種鑒定中起著不可替代的作用，然而隨著DNA 條形碼的研究不斷出現，有學者發現不同物種DNA 條形碼的閾值各不相同，沒有一個統一的標準閾值［29］。BOLD 數據庫最初將遺傳距離1%作為生物物種的劃分閾值，由于其閾值寬泛，在一定程度上造成了物種的鑒別過度，導致同種異名的出現，為了不使物種混亂，近年來BOLD 系統默認鑒別閾值為3%［30］；Meier 等［31］在對449 個雙翅目昆蟲物種的研究中，發現在物種劃分時，其遺傳距離大于3%；He?bert 等［5］以3%作為閾值對200 個鱗翅目昆蟲物種進行鑒別；蜉蝣目［32-34］、襀翅目和毛翅目［35，36］的物種以2%的閾值就能將物種區分開。本試驗研究的物種隸屬于雙翅目，通過使用ABGD 方法評估得到的遺傳距離閾值為3%～4%，與Meier 等［31］的研究相符，且與搖蚊亞科中其他屬研究的閾值差異不大，Song 等［15］區分多足搖蚊屬的遺傳距離閾值為5%～8%，Lin 等［14］區分長跗搖蚊屬的遺傳距離閾值為4%～5%。本研究是分析搖蚊屬物種的DNA 條形碼，其屬于搖蚊亞科中比較大的屬級之一，屬內物種的豐富度極高，但由于時間有限，加之中國地大物博，從而不能完全覆蓋已記錄所有物種和一些隱種；為此還需要更深入的研究，才能達到對中國地區搖蚊屬遺傳距離的準確界定。

系統發育樹能直觀地反映物種之間的親緣關系，本研究采用的是鄰接樹法，其基于遺傳距離和最小進化原理，通過自舉檢驗法進行聚類，并通過統計給定樹分支的可信度，得出最優樹［37］。在鄰接樹中，基于54 條來自實驗室的DNA 條形碼明顯分離出12 個物種，與形態學鑒定結果一致，匹配率達92.3%；通過結合BOID 和Genbank 數據庫中的695條DNA 條形碼，分離出50 個形態種，其中發現本試驗數據Chironomus pseudothummi 與參比數據Chi?ronomus sp.TE11 聚為一支（圖4），由于數據庫中參比數據Chironomus sp.TE11 不能提供證據標本與本研究比較，將基于本研究的數據將參比數據Chi?ronomus sp.TE11 修 改 為Chironomus pseudothummi，并將相關信息上傳至BOLD 數據庫。

圖4 Chironomus pseudothummi 類群鄰接樹

4 結論

本研究通過采集中國地區的搖蚊屬昆蟲12 種54 個樣本，結合BOID 和Genbank 數據庫中的相關數據，共計749 條DNA 條形碼，運用ABDG 法分析該數據集遺傳距離，結果顯示種內與種間存在一個明顯的空白區；基于鄰接樹結果得出數據集分離出50 個物種，與傳統形態學鑒定一致，匹配率高達92.3%，并修正數據庫中Chironomus sp.TE11 為Chironomus pseudothummi，證明DNA 條形碼能有效鑒別搖蚊屬昆蟲。本研究的數據均已上傳中國DNA 條形碼數據庫，在豐富中國搖蚊科數據庫的同時，也為探索DNA 條形碼在搖蚊昆蟲中鑒別的有效性提供了基礎數據。