豬CD150 真核表達載體的構建及其在Marc-145 細胞中的穩定表達

張 蘭，梁 婉，周丹娜，楊克禮，郭 銳，李 鵬，田永祥

（1.長江大學動物科學學院，湖北荊州 434025；2.湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所，武漢 430064）

淋巴細胞刺激因子CD150 是一種細胞表面受體及共刺激因子，表達于巨噬細胞等免疫細胞及上皮細胞表面［1］。研究表明，CD150 對于宿主激活和維持天然免疫具有十分重要的作用。CD150 可以通過RIG-I、Toll 樣受體，激活NF-κB、P38-MAPK、PI3K- Akt 等多條信號通路，從而促進IRF-3 介導的IFNs、TNF-α 及 多 種 白 介 素 因 子 的 分 泌［2，3］。CD150 可以刺激CD4+、CD8+T 細胞的激活、分化［4］，還與巨噬細胞、DC 細胞和骨髓細胞的遷移能力有著密切關系［1］。CD150 還能隨病原進入吞噬體內，促進吞噬體成熟，激活細胞自噬。因此，CD150 在激活宿主抗病毒免疫反應的過程中發揮著重要作用。然而，豬CD150 的功能尚未見報道。本試驗擬克隆豬CD150 基因全長，并對其進行真核表達，為CD150在宿主與PRRSV 互作機制研究提供基礎依據。

1 材料與方法

1.1 載體、細胞及抗體

真核表達載體pEGFP-N1 為本實驗室保存。非洲綠猴腎傳代細胞系Marc-145 購于中國典型培養物保藏中心，在本實驗室進行凍存、復蘇及使用。CD150 一抗、HRP 標記的山羊抗鼠IgG，購自武漢三鷹生物技術有限公司。

1.2 主要試劑

DL 2000 Marker、DL 5000 Marker、限制性內切酶、質粒小提試劑盒、DH5α 感受態細胞、核酸提取試劑盒、反轉錄試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、PCR 高保真酶、DNA 連接酶、去內毒素質粒提取試劑盒、ECL 發光顯色液等，購自南京諾唯贊生物科技有限公司；蛋白質Marker、脫脂奶粉、SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒，購自上海碧云天公司；FBS、DMEM、Opti-MEM培養基、0.25%胰蛋白酶，購自Gbico公司；Lipofectamine 2000 轉染試劑盒購自Invitrogen 公司。

1.3 主要儀器

倒置熒光顯微鏡，奧林巴斯公司；PCR 擴增儀、紫外凝膠成像系統，BioRad 公司；電泳儀，六一儀器廠；二氧化碳細胞培養箱，Thermo 公司；5810R 低溫離心機，Eppendorf公司。

1.4 方法

1.4.1 CD150 基因的克隆 基于GenBank 發表的豬源CD150 基因和pEGFP-N1 載體序列設計CD150 真核表達引物。引物序列為5'-CCGCTCGAGGCCAC CATGCATAAACTAGACAGTAGAGGCA-3'（酶切位點XhoI）和5'-CCAAGCTTGCTCTCCGGAAGAGTCA CG-3'（酶切位點Hind III），由擎科生物股份有限公司合成引物。

按照RNA 提取試劑盒和反轉錄試劑盒說明書提取豬的基因組，反轉錄為cDNA，置-80 ℃冰箱保存，備用。以豬的cDNA 為模板進行PCR 擴增。PCR擴增體系（總體積為50 μL）：2×Phanta Max Master Mix 25 μL，上下游引物各2.5 μL，DNA 模板2 μL，ddH2O 18 μL。PCR 擴增程序：95 ℃3 min，95 ℃15 s，55 ℃15 s，72 ℃5 min，共35 個循環；72 ℃10 min，16 ℃保存。反應結束后以1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物，并通過切膠回收大小正確的片段。

1.4.2 真核重組表達載體的構建和鑒定 用限制性內切酶對真核表達載體pEGFP-N1 和CD150 基因片段分別酶切并回收后，按照說明書進行DNA 片段連接。將連接產物轉化至大腸桿菌DH5α 感受態細胞中，挑取大小、形態合適的單菌落搖菌并小量提取質粒，送擎科生物股份有限公司測序。

1.4.3 真核重組表達載體轉染Marc-145 細胞 按照說明書提取去內毒素的質粒，待細胞密度達70%～80%時進行轉染。將2 μg重組質粒加入100 μL Opti-MEM 培養基；將4 μL 轉染試劑Lipofectamine 2000 加入Opti-MEM 培養基；室溫靜置5 min 后，將兩者混合，繼續室溫孵育20 min。取出鋪好Marc-145 細胞的6 孔細胞培養板，PBS 輕柔洗滌細胞2 次，將轉染試劑混合物加入細胞中，置CO2培養箱中37 ℃靜置培養4～6 h，換成含2%胎牛血清的DMEM維持培養基繼續培養12～24 h 后進行后續試驗。

1.4.4 Western-blot 鑒定 PBS 洗滌細胞3 次后，加入200 μL 細胞裂解液，充分吹打裂解后收集裂解液，12 000 r/min 離心20 min；取40 μL 上清液，加入10 μL 上樣緩沖液，充分混勻后煮沸10 min；冰上靜置20 min 后將樣品點入制備的SDS 蛋白凝膠中電泳分離目標蛋白；采用半干轉的方式進行蛋白轉膜。轉膜結束后，用TBST 清洗PVDF 膜3 次，5 min/次，然后將PVDF 膜放入用TBST 稀釋的5%脫脂奶粉中，4 ℃封閉過夜；封閉結束后將PVDF 膜再次清洗3次，然后將膜放入提前用1%脫脂奶粉以1∶5 000 比例稀釋的CD150 一抗中，室溫孵育2 h；TBST 清洗3次，10 min/次；加入1∶5 000 稀釋的HRP 標記的山羊抗鼠IgG 二抗；室溫孵育1.5 h；TBST 清洗3 次，10 min/次；ECL 試劑盒顯色1 min 后采集成像。

2 結果與分析

2.1 CD150 基因的克隆

PCR 擴增的CD150 基因片段經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在1 033 bp 處出現明亮條帶（圖1），與預期大小相符。

圖1 CD150 基因PCR 擴增結果

2.2 真核重組表達載體的構建和鑒定

利用雙酶切對挑取的單菌落質粒進行鑒定，瓊脂糖凝膠電泳顯示出現了與預期大小的兩條條帶（圖2），表明CD150 已連接到pEGFP-N1 載體上。將鑒定正確的陽性質粒送測，并將測序結果與NCBI公布的豬基因組序列進行對比。結果顯示克隆到的CD150 基因與目的片段比對結果為100%（圖3）。

圖2 pEGFP-N1-CD150 質粒酶切產物電泳

圖3 pEGFP-N1-CD150 測序結果比對

2.3 真核重組質粒轉染Marc-145 細胞

利用脂質體瞬時轉染法將重組質粒pEGFPN1-CD150 和空載體pEGFP-N1 分別轉染至Marc-145 細胞中，過表達24 h 后，在倒置熒光顯微鏡下觀察熒光表達情況。結果表明，pEGFP-N1-CD150 和pEGFP-N1 轉染后均可顯示強烈綠色熒光（圖4），提示pEGFP-N1-CD150 已成功表達。

2.4 Western-blot 鑒定CD150 和EGFP 融合表達情況

裂解收集轉染后24 h 的細胞總蛋白，利用Western-blot 檢測EGFP 蛋白和CD150 蛋白的表達情況。結果顯示，轉染pEGFP-N1 后，僅可見大小約為29 kDa 的蛋白條帶（圖5），與預期EGFP 蛋白大小相符；轉染1～3 μg 的pEGFP-N1-CD150 后，均可見大小約80 kDa 的蛋白條帶（圖6），蛋白大小與預期的EGFP-CD150 融合蛋白大小相符，隨轉染量的增加而表達量逐漸變多，表明pEGFP-N1-CD150 融合表達成功。

圖5 pEGFP-N1 Western-blot 結果

3 小結與討論

研究表明，CD150 對于激活和維持機體天然免疫具有十分重要的作用。一方面，CD150 通過胞質區的免疫受體酪氨酸轉換基序（Immunoreceptor ty?rosine-based switch motifs，ITSM）與受體蛋白形成二元復合體，通過受體蛋白與下游信號分子的結合，形成三元復合體來激活免疫應答［5］。利用復合體中的受體蛋白，CD150 可激活RIG-I、Toll 樣受體，增強NF-κB、P38 MAPK、Akt、PI3K 等多條信號通路，從而促進IRF-3 介導的IFNs、TNF-α 及多種白介素因子的分泌［5］。當病原侵入機體時，巨噬細胞等抗原呈遞細胞通過肌動蛋白重排形成吞噬體囊泡將病原包裹內吞，初級吞噬體囊泡成熟后與溶酶體融合形成吞噬溶酶體，及時殺滅及降解病原［6］。

CD150 基因已被報道在其他物種的天然免疫中具有十分重要的作用，本研究成功構建了CD150 的真核表達載體，通過Western-blot、觀察轉染后的熒光鑒定了融合表達的效果。本研究試驗結果主要是pEGFP-N1-CD150 真核表達載體的共構建，研究結果為探索豬CD150 的功能提供了基礎數據。