基于網(wǎng)絡藥理學中藥復方“三藥三方”治療新冠肺炎的分期治療分析＊

蔡 羽 ，曾 珉 ，陳運中

（1. 湖北中醫(yī)藥大學藥學院 武漢 430065；2. 湖北省中藥保健食品工程技術研究中心 武漢 430065）

2019 年底，武漢地區(qū)首先報道爆發(fā)新型冠狀肺炎（COVID-19），新冠肺炎被世界衛(wèi)生組織定義為“全球大流行”；到目前為止全球疫情統(tǒng)計數(shù)據(jù)表示已累計確診超過1115 萬人，死亡人數(shù)接近53 萬人，COVID-19 對社會造成一定的負面影響，同時值得一提的是，新型冠狀肺炎發(fā)源地尚不明確，中國對武漢不明原因肺炎疫情反應快速、態(tài)度公開透明。國家衛(wèi)生健康委員會發(fā)布的《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第7 版）》提及新冠病毒的病原學特點是其屬于β屬的冠狀病毒，有包膜，顆粒呈圓形或橢圓形，常為多形性，直徑60-140 nm；流行病學顯示，該病可通過呼吸道飛沫、糞口以及接觸等方式傳染[1]。SARS-CoV-2利用S蛋白與機體的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（ACE2）蛋白結(jié)合實現(xiàn)入侵過程，其入侵機理與SARS-CoV相類似，病毒入侵后機體出現(xiàn)炎癥因子失調(diào)，產(chǎn)生炎癥過度反應，加快病情并且產(chǎn)生多器官衰竭等臨床表現(xiàn)。研究表明，ACE2 是SARS-CoV-2 入侵機體的關鍵因子，其分布于在肺、心臟、睪丸、大動脈、腎臟和腸道等器官組織，同時SARS-CoV-2 侵入機體后，普通型和輕癥只是出現(xiàn)干咳、發(fā)熱和全身乏力，當轉(zhuǎn)化為重癥后，患者出現(xiàn)急性呼吸窘迫綜合征和多器官衰竭等嚴重臨床癥狀[2-4]。

在無特效藥和疫苗的情況下，中醫(yī)藥在抗擊新冠疫情發(fā)揮著重要的作用，其中在91.5%確診病例使用，有效治療率達到90%以上，特別是《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第7 版）》中推薦的“三藥三方”[2,5]，在中西醫(yī)思想并重的指導下，展示出良好的臨床治療效果。在中醫(yī)藥辨證論治、動態(tài)觀、整體觀的思想指導下，結(jié)合臨床實踐總結(jié)凝練出“三藥三方”：化濕敗毒方、清肺排毒湯、宣肺敗毒方、金花清感顆粒、連花清瘟膠囊、血必凈注射液[5]，“三藥三方”具有減輕發(fā)熱癥狀、減少激素用量和減輕并發(fā)癥等方面作用，同時在改善嘔惡、便秘癥狀、退熱、控制病情進展、靶器官保護和維護心肺腎功能等方面具有作用，另外其與西藥相比，表現(xiàn)為縮短臨床癥狀消失時間和減少平均住院時間，同時降低普通型轉(zhuǎn)化為危重型的幾率。

基于多成分-多靶點-多通路的中藥治療，其藥理機理較為復雜，本研究通過網(wǎng)絡藥理學的應用初步闡述了藥物作用機理，網(wǎng)絡藥理學是研究中醫(yī)藥的有效方法，也是中醫(yī)現(xiàn)代化的關鍵之一，其有利于詳細解釋中醫(yī)藥發(fā)揮的系統(tǒng)調(diào)控作用。同時分子對接能夠從分子水平解釋化合物和蛋白質(zhì)結(jié)合情況，從分子角度上揭示藥物作用的具體機理[6-8]。本研究通過網(wǎng)絡藥理學和分子對接研究方法，以辨證論治、治病求因、正氣存內(nèi)、已病防變的中醫(yī)思想指導下，收集和分析“三藥三方”的成分、靶點和通路，構建靶標網(wǎng)絡并且進行KEGG 富集，探尋“三藥三方”治療COVID-19 的功能調(diào)控關系，并且比較不同復方作用機理的異同初步分析“三藥三方”治療新冠肺炎的分期治療特點，展現(xiàn)中醫(yī)藥整體治療和辨證治療的特色。

1 材料與方法

1.1 成分和靶點信息收集

從《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第7版）》中查找“三藥三方”的復方組成，分別收集6 種復方的藥材組成成分，初步構建中藥復方數(shù)據(jù)庫[1]。復方藥材成分及其關鍵靶點的收集是通過ETCM 中藥數(shù)據(jù)庫（http://www.tcmip.cn/ETCM/）實現(xiàn)，ETCM 數(shù)據(jù)庫包含中醫(yī)藥綜合信息，特別是復方、藥材、成分和靶點[9]。另外，利用BATMAN 數(shù)據(jù)庫完善藥材、成分和靶點信息。

1.2 交集分析

疾病靶點基因包含5556 種與ACE2 共表達的基因，其是通過結(jié)腸上皮細胞單細胞序列鑒定結(jié)果[10]。對各自的復方成分靶點與疾病靶點進行交集處理，最終獲得各自復方的藥理作用關鍵靶點，并且利用UniProt 數(shù)據(jù)庫對靶點進行標準化處理[11]。同時通過TBtools 生信分析工具來實現(xiàn)對6 個復方的藥材、化合物和靶點進行交集處理。

1.3 蛋白互作網(wǎng)絡分析

利用 STRING 數(shù)據(jù) 庫（https://string-db. org/cgi/input.pl）構建關鍵靶點的PPI 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡[12]，利用Cytoscape 軟件對PPI 靶點互作網(wǎng)絡進行分析處理，并且利用MCODE 插件實現(xiàn)分解模塊的功能，從而達到復雜網(wǎng)絡分模塊的處理[13]。

1.4 KEGG通路富集

利用DAVID 數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/）進行KEGG 通路分析，分別將6 個復方的關鍵靶點以及交集靶點共7 組數(shù)據(jù)導入到DAVID 數(shù)據(jù)庫，使用KEGG數(shù)據(jù)庫進行通路富集分析。同樣地，7 組數(shù)據(jù)分別導入Metascape 數(shù)據(jù)庫（http://metascape.org/gp/index.html#/main/step1）進行富集分析，獲取通路以及生物過程的關聯(lián)[14,15]。兩種數(shù)據(jù)庫的分析，互相對比補充地揭示復方藥理作用機制，以及從多種角度獲取復方通路作用的異同。

1.5 分子對接分析

利用分子對接數(shù)據(jù)庫（https://ncov.schanglab.org.cn/index.php）對化合物與蛋白質(zhì)進行對接[16]，具體化合物以及蛋白質(zhì)見表6，13 種交集化合物與12 種關鍵蛋白完成分子對接模型實驗。

另外利用D3Targets-2019-nCoV 數(shù)據(jù)庫（https://www.d3pharma.com/D3Targets-2019-nCoV/index.php）對“三藥三方”中活性化合物與新冠病毒肺炎相關蛋白質(zhì)進行分子對接，具體化合物和靶點見表7，12種化合物均是“三藥三方”活性化合物，具有潛在的生物活性和藥理治療活性，14 種蛋白質(zhì)與新冠病毒藥物研究靶點相關[17]。

1.6 復方分析

通過ETCM 數(shù)據(jù)庫收集復方的性質(zhì)包括藥味歸經(jīng)等數(shù)據(jù)，對于上述提到不存在的藥材從網(wǎng)絡獲取信息，獲取復方信息后利用Cytoscape 軟件進行可視化網(wǎng)絡圖構造，同時繪制藥材性質(zhì)比例圖，以及對復方數(shù)據(jù)進行匯總分析和對比分析。

2 結(jié)果

2.1 復方成分與靶點收集

最終收集到6種復方化濕敗毒方、清肺排毒湯、宣肺敗毒方、金花清感顆粒、連花清瘟膠囊和血必凈注射液，分別命名為復方1（Formula 1）、復方2（Formula 2）、復方 3（Formula 3）、復方 4（Formula 4）、復方 5（Formula 5）和復方6（Formula 6），同時繪制復方化合物和靶點統(tǒng)計表格（表1）。復方6包含最少藥材、化合物和靶點數(shù)量，復方2包含最多的藥材、化合物和靶點數(shù)量。具體來講，復方1 包含14 種中藥，562 種成分和1195 種潛在靶點，其中甘草（licorice）包含較多的化合物成分，蒼術（Atractylodes Lancea（Thunb.）Dc.）包含較多的潛在靶點；復方2 包含21 種中藥、829 種成分和1477 種潛在靶點，其中甘草（licorice）包含較多化合物成分，山藥（Rhizoma Dioscoreae）包含較多的潛在靶點；復方 3 包含 13 種中藥、502 種化合物成分和 1231 種潛在靶點，其中甘草（licorice）包含較多化合物成分，蒼術（Atractylodes Lancea（Thunb.）Dc.）包含較多的潛在靶點；復方4包含12種中藥、481種化合物成分和1221種潛在靶點，其中知母（Anemarrhenae Rhizoma）包含較多化合物成分，薏苡仁（Fritillariae Thunbrgii Bulbus）包含較多潛在靶點；復方5 包含13 種中藥、546 種化合物成分和1399 種潛在靶點，其中甘草（licorice）包含較多的化合物成分，板藍根（Isatidis Radix）包含較多的潛在靶點；復方6包含5種中藥、266種化合物成分和750種潛在靶點，其中丹參（Radix Salviae）包含較多的化合物，紅花（Carthami Flos）包含較多的潛在靶點。

2.2 復方交集分析

復方的靶點與疾病靶點通過交集分析得到各自的關鍵靶點，并且繪制各自的Venn 圖（圖1）。復方1到復方 6 的核心靶點分別有256、318、47、264、305 和175 個，其中復方2 靶點最多，復方3 靶點最少，利用UniProt數(shù)據(jù)庫對核心靶點標準化處理。

利用Venn圖和TBtools工具獲取6種復方的藥材、化合物和靶點的交集，并且繪制可視化圖形（圖2）。對于化合物而言，6 種復方的共同交集化合物有6 個，具體為 Lauric Acid（月桂酸）、Sitosterol（谷甾醇）、Alexandrin（胡蘿卜甙）、Chuanxiongzine（川芎嗪）、Cetylic Acid（棕櫚酸）和Oleanolic Acid（齊墩果酸）；對于藥材而言，6種復方?jīng)]有共同的藥材交集；對于關鍵靶點而言，6種復方的共同關鍵靶點交集數(shù)量有25種，通過Uniprot數(shù)據(jù)庫進行標準化處理，完成關鍵交集靶點的表格繪制（表2）。關鍵交集靶點中通過網(wǎng)絡拓撲分析可知，Cytochrome P450 2B6（細胞色素P450 2B6）、Broad substrate specificity ATP-binding cassette transporter（ABCG2 廣譜底物特異性 ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體 ABCG2）、Cytochrome P450 2C19（細胞色素 P450 2C19）和 ATP-dependent translocase ABCB1（ATP 依賴性轉(zhuǎn)位酶ABCB1）的Degree（連接程度）較高；細胞色素P450 2C19、Amine oxidase（細胞色素P450 2B6、胺氧化酶）和Gamma-aminobutyric acid receptor subunit alpha-2（γ-氨基丁酸受體亞單位α-2）的Betweenness（中介中心性程度）較高；細胞色素P450 2B6、廣譜底物特異性ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體ABCG2、細胞色素P450 2C19 和 ATP 依 賴 性 轉(zhuǎn) 位 酶 ABCB1）的 Closeness Centrality（緊密中心性）程度較高。

2.3 蛋白互作分析

通過相關數(shù)據(jù)庫以及相關軟件的使用，最終完成圖3-圖4 的繪制。復方1 的PPI 網(wǎng)絡圖包含244 個點和1394 條邊，其中靶點連接度高的靶點是MAPK3、GAPDH、ESR1、NRNH4等靶點；復方2的PPI網(wǎng)絡圖包含308 個點和1963 條邊，其中連接度高的靶點是GAPDH、MAPK3、EGF、ACTB、ESR1 等靶點；復方3 的PPI 網(wǎng)絡圖包含35 個點和80 條邊，其中連接度高的是CYP2C9、CYP2C19、CYP2B6、ABCB1 和 ABCG2 等靶點；復方 4 的 PPI 網(wǎng)絡圖包含 254 個點和 1442 條邊，其中連接度高的靶點是GAPDH、MAKP3、ESR1、PPARG和 ACTB；復方 5 的 PPI 網(wǎng)絡圖包含 291 個點和 1814 條邊，其中連接度高的靶點是GAPDH、MAKP3、PPARG、ESR1 和 ATP5B；復方 6 的 PPI 網(wǎng)路圖包含 159 個點和669 條邊，其中連接度高的靶點是CYP2B6、ESR1、PPARG、ABCB1、ABCG2 和 SOD1；交集靶點的 PPI 網(wǎng)路圖包含19 個點和48 條邊，其中連接度高的靶點是GABRE、GABRB1 和GABRA2，另外PPI 網(wǎng)絡拓撲分析的結(jié)果展示 Degree，Closeness Centrality 和 Betweenness，其結(jié)果見表2。利用MCODE 插件對7 個PPI網(wǎng)絡圖進行子模塊的分析，并且完成分模塊圖形的繪制。復方中PPI 網(wǎng)絡圖分解模塊分別含有11、12、4、9、8、8 和2個分模塊，各復方含有各自的分模塊，但對于ABCB1等共同靶點6 個復方具有相似性，靶點具有相似性的分模塊。特別是在交集關鍵靶點PPI 分模塊中，存在7-蛋白功能網(wǎng)路和3-蛋白功能，其中7-蛋白功能網(wǎng)路包含細胞色素P450 與ATP 相關蛋白、核受體的關聯(lián)，3-蛋白功能網(wǎng)絡包含γ-氨基丁酸受體之間的關聯(lián)。同時利用Omicsmean 數(shù)據(jù)庫分析核心靶點PPI 分模塊蛋白的生物功能，詮釋“三藥三方”分模塊蛋白發(fā)揮的生物功能，展示蛋白的GO 生物過程以及KEGG通路，繪制表3顯示“三藥三方”分模塊蛋白生物功能。

表1 6種復方的化合物和靶點信息

續(xù)表

2.4 KEGG通路分析

通過DAVID 數(shù)據(jù)庫的分析，最終各復方得到52、57、13、45、49 和 38 條 KEGG 通路，并且交集靶點調(diào)控16 條KEGG 通路，并且使用R 語言畫出交集靶點的通路氣泡圖（圖5），最終得到各復方調(diào)控7條KEGG 通路交集，與交集靶點調(diào)控通路進行合并得到16 條KEGG通路，并對其進行分類制作成表格（表4）。通過Metascape 數(shù)據(jù)庫分析關鍵靶點得到具體生物通路的關聯(lián)圖，同時兩個數(shù)據(jù)庫應用從不同角度說明關鍵靶點的生物通路調(diào)控，兩個數(shù)據(jù)庫得到的結(jié)果具有相似性，DAVID 得到的是整體范圍的通路調(diào)控，而Metascape數(shù)據(jù)庫則更強調(diào)的是通路關聯(lián)程度，同時繪制復方的性質(zhì)、通路的異同表格（表5）。“三藥三方”交集關鍵靶點共同參與調(diào)控具體表現(xiàn)為：①神經(jīng)保護作用；②免疫調(diào)節(jié)以及抗炎癥風暴調(diào)節(jié)；③內(nèi)分泌調(diào)節(jié)以及性激素調(diào)控；④能量代謝調(diào)控；⑤藥物代謝；⑥其他通路。同時表5反映復方調(diào)控生物通路的關聯(lián)性和區(qū)別性，復方共同調(diào)控神經(jīng)保護、能量代謝、炎癥和內(nèi)分泌調(diào)節(jié)，復方也反映各自功能生物通路調(diào)控的獨特之處，復方4 和復方5 參與ACE2 相關的通路，表現(xiàn)出與ACE2 相關通路的調(diào)控，復方4 和復方5 發(fā)揮藥理作用影響到SARS-CoV-2 利用S 蛋白與ACE2 蛋白結(jié)合的過程，其反映阻止病毒入侵的藥理作用。

圖1 6種復方靶點與疾病靶點的Venn交集

2.5 分子對接結(jié)果

通過分子對接數(shù)據(jù)庫最終得到對接結(jié)合分數(shù)能量表格（表6），同時利用Discovery Studio 軟件將對接結(jié)果可視化（圖6）。交集化合物分子對接結(jié)合力普遍不高，說明交集共同化合物發(fā)揮直接藥理作用較弱，側(cè)面反應通過其他化合物發(fā)揮藥理作用，同時也有部分化合物與蛋白質(zhì)分子結(jié)合情況好，圖6 列舉部分結(jié)合情況好的復合物，展示部分化合物與殘基的作用情況。蛋白質(zhì)二維結(jié)合圖反映化合物與具體氨基酸殘基的相互作用，部分化合物與關鍵蛋白質(zhì)以分子間相互作用為主，同時存在靜電相互作用，另外二維蛋白質(zhì)作用圖反映具體氨基酸殘基的作用情況。

對于交集化合物與特定關鍵蛋白結(jié)合強的情況，Alexandrin（胡蘿卜甙）與Papain-like protease（木瓜蛋白酶類水解酶）、Nsp14（N7-MTase）（非結(jié)構蛋白C 端鳥嘌呤-N7 甲基轉(zhuǎn)移酶）和E protein（ion channel）（包膜小膜蛋白）表現(xiàn)良好的結(jié)合能力，木瓜蛋白酶類水解酶與Mpro（主蛋白酶）一起切割病毒基因組翻譯的蛋白前體，得到非結(jié)構蛋白，replicase-transcriptase complex（組裝復制-轉(zhuǎn)錄酶復合體），除了參加切割加工的蛋白酶活性外，其是SARS 病毒編碼的宿主干擾素拮抗蛋白，其在SARS 調(diào)節(jié)宿主抗病毒天然免疫反應中發(fā)揮重要功能[18]；Nsp14（非結(jié)構蛋白14）具有雙重酶活性，與Nsp10（非結(jié)構蛋白10）形成復合物發(fā)揮功能，C 端結(jié)構域具有鳥嘌呤-N7 甲基轉(zhuǎn)移酶活性，負責對 mRNA 加帽，SARS 冠狀病毒 nsp14 近 C 端區(qū)域有鳥嘌呤-N7-甲基轉(zhuǎn)移酶活性，其在RNA 加帽過程起著重要作用，且其活性依賴nsp14 近N 端核酸外切酶活性區(qū)域的存在[19]；Envelop small membrane protein（包膜小膜蛋白）形成五聚體并具有離子通道功能，同時E蛋白與病毒入侵宿主緊密相關，其被認為與病毒的感染能力相關[20]。胡蘿卜甙與上述3 種關鍵蛋白質(zhì)結(jié)合力強，其阻斷病毒的潛在藥理作用涉及到切割病毒基因組翻譯的蛋白前體、調(diào)節(jié)宿主抗病毒免疫反應、阻斷mRNA 加帽以及影響介導病毒入侵宿主細胞。Oleanolic Acid（石竹素）與RdRp with RNA RNA（依賴的RNA 聚合酶）、Nsp16（2'-O-MTase）（2'-O-甲基轉(zhuǎn)移酶）和包膜小膜蛋白表現(xiàn)良好結(jié)合能力。同時RNA依賴的RNA 聚合酶結(jié)構包括Nsp12 與RNA，在病毒基因組的復制與轉(zhuǎn)錄中具有重要作用，同時與病毒引起宿主免疫反應相關[21]；Nsp16（2'-O-MTase）（2'-O-甲基轉(zhuǎn)移酶）通過對核苷酸核糖添加甲基化修飾，可幫助病毒逃避宿主的識別而逃避宿主的天然免疫，針對其設計的抑制劑可有效抑制病毒的復制，對病毒的有效增殖以及RNA 的合成和穩(wěn)定起著重要作用[22]。通過上述3種關鍵蛋白Oleanolic Acid（石竹素）表現(xiàn)出阻止SARS-CoV-2 的復制、轉(zhuǎn)錄、增殖和介導影響病毒侵入機體的潛在藥理作用。

表2 6種復方交集靶點信息

圖2 6種復方的功能交集圖

圖3 交集靶點PPI蛋白互作網(wǎng)絡圖

對于“三藥三方”活性成分與新冠病毒相關蛋白結(jié)合情況，繪制表7 具體說明化合物與蛋白質(zhì)的結(jié)合情況，結(jié)果主要反映活性化合物與新冠病毒受體相關蛋白的結(jié)合情況，對接結(jié)果整體結(jié)合情況較好。其中ACE2 是SARS-CoV-2 入侵機體的關鍵因子，跨膜蛋白酶TMPRSS2 能夠激活高致病性人冠狀病毒的突觸蛋白，其可裂解并激活SARS-CoV 的S 蛋白進行膜融合，同時TMPRSS2 與金屬蛋白酶ADAM17 在結(jié)合ACE2 時存在競爭關系，ADAM17 除與病毒感染相關，其還可介導心肌病和糖尿病，能夠介導ACE2 膜上脫落調(diào)節(jié)心血管功能[2,22,23]。SARS-CoV 可能通過S 蛋白上的高甘露聚糖與質(zhì)膜上的CD209L 結(jié)合，再介導病毒進入宿主細胞，其可能是SARS-CoV的弱受體，研究表明CD209L 的多肽區(qū)域變體的雜合表達可能會改變病毒與配體的結(jié)合能力，炎性因子在SARS 感染中同樣起作用，其有助于增加SARS 的易感性[24,25]。DHODH 抑制劑可對輪狀病毒具有抗病毒作用，同時輪狀病毒與冠狀病毒屬于RNA 病毒，同時最近發(fā)現(xiàn)DHODH 的新型有效抑制劑對RNA病毒具有廣譜抗病毒感染的特點[26]。3CLPro 是冠狀病毒復制所必須的酶，可作為有效的抗病毒藥物靶點[27]。Cathepsin L（組織蛋白酶），其是SARS 病毒的S 蛋白與細胞膜融合時必須的一種酶[28]。上述蛋白質(zhì)為治療新冠病毒的關鍵蛋白靶點，驗證活性化合物與上述蛋白質(zhì)有利于闡述“三藥三方”的潛在治療性，為“三藥三方”基礎研究和臨床研究提供理論證據(jù)。

圖4 交集靶點PPI蛋白互作網(wǎng)絡MCODE模塊分解圖

表3 核心靶點PPI分模塊蛋白生物通路功能

續(xù)表

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2.6 復方分析結(jié)果

通過Cytoscape 軟件繪制出藥材的歸經(jīng)、藥性和藥味的網(wǎng)絡圖（圖7-圖9），同時繪制藥材歸經(jīng)、藥味和藥性的百分比堆積柱狀圖（圖10）。結(jié)合網(wǎng)絡圖以及百分比堆積柱狀圖可知，對于歸經(jīng)而言復方1 到復方5以肺經(jīng)為主，其余不同復方在脾經(jīng)、心經(jīng)和胃經(jīng)占據(jù)一定重要比例，而復方6則以肝經(jīng)為主，其次的是脾經(jīng)和心經(jīng)；對于藥性而言，復方1 到復方5 分別是寒性藥和溫性藥各占據(jù)各自的重要比例，而復方6 則以溫性要為主，不存在寒性藥；對于藥味而言，6 種復方均具有相似性，均是苦味藥、辛味藥和甘味藥各占重要比例，只是占據(jù)比重分配不同。

3 討論

化濕敗毒方、清肺排毒湯、宣肺敗毒方、金花清感顆粒、蓮花清瘟膠囊和血必凈注射液這“三藥三方”在抗擊新冠疫情發(fā)揮著重要的作用，本研究通過網(wǎng)絡藥理學和中醫(yī)理論系統(tǒng)分析“三藥三方”的潛在治療機制和各自藥材的性味歸經(jīng)，通過數(shù)據(jù)庫的查詢搜集“三藥三方”6 種復方的成分、靶標信息、藥味、藥性和歸經(jīng)情況，并且構建各自復方以及共同靶點的靶標網(wǎng)絡，分析靶點干預的生物學過程和KEGG通路，通過可視化呈現(xiàn)復方的藥理特點，從多角度揭示6 種復方多成分-多靶點-多通路的藥理分子機理。

基于網(wǎng)絡藥理學的研究方法，通過ETCM 數(shù)據(jù)庫獲取“三藥三方”的成分、靶點和藥味歸經(jīng)，ETCM 數(shù)據(jù)庫包含 402 種中藥、3962 種復方、7284 種中藥成分、2266種靶點和4323種相關疾病，同時網(wǎng)絡藥理學研究使用較多的數(shù)據(jù)庫—TCMSP數(shù)據(jù)庫包含499種中藥和12144 種化合物，通過數(shù)據(jù)庫對比得出ETCM 數(shù)據(jù)庫中藥和成分查詢存在數(shù)量上的差異，但同時其靶點預測是基于MedChem Studio 軟件和DrugBank 數(shù)據(jù)庫，然后建立較為完備的靶點數(shù)據(jù)庫，故靶點預測的準確性和查全性具有優(yōu)勢。同時ETCM 數(shù)據(jù)庫注重中醫(yī)藥信息庫的建立，包括中藥復方、藥味歸經(jīng)等信息，針對本研究使用的藥味歸經(jīng)，其與實際藥味歸經(jīng)相符合。總的來說，通過從ETCM 數(shù)據(jù)庫獲取“三藥三方”成分、靶點和藥味歸經(jīng)符合準確性、查全性，但介于本研究重點比較“三藥三方”的生物機理的異同和分期治療特點，利用數(shù)據(jù)庫仍然具有一定局限性，特別是對于血清和組織藥物化學、多成分藥代動力學的研究不足，同時僅僅基于ETCM 數(shù)據(jù)庫核心指標篩選復方成分、靶點，未按照常規(guī)網(wǎng)絡藥理學方法對口服吸收率（OB）、類藥性（DL）等生物指標篩選活性化合物進而進一步預測靶點。

表4 合并通路的具體分類

表5 復方特征以及功能調(diào)控通路異同

圖5 交集靶點的通路氣泡圖

通過網(wǎng)絡藥理學研究分析，6種復方中有6個化合物交集和25 個交集靶點，無藥材交集，并且通過通路分析得到16條通路，并且識別了各自的靶標網(wǎng)絡并且分解成各自功能的子模塊，特別是對于共同靶標的2個功能模塊，包括γ-氨基丁酸受體亞基相互作用以及細胞色素、ATP 依賴轉(zhuǎn)位酶和核受體的相互作用，分模塊與藥物代謝、心血管調(diào)節(jié)和神經(jīng)調(diào)節(jié)有密切關系。同時對于交集靶點富集后的通路，表明復方具有共同調(diào)節(jié)的功能，以及從不同角度闡述復方的關聯(lián)性以及不同點，初步揭示復方共同調(diào)控的生物通路：①神經(jīng)保護作用；②免疫調(diào)節(jié)以及抗炎癥風暴調(diào)節(jié)；③內(nèi)分泌調(diào)節(jié)以及性激素調(diào)控；④能量代謝調(diào)控；⑤藥物代謝；⑥其他通路。具體分析如下：

圖6 部分交集化合物與蛋白質(zhì)對接圖

神經(jīng)保護調(diào)節(jié)。在《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第7 版）》尸檢報告中，病理改變提及“腦組織充血、水腫，部分神經(jīng)元變性”[1]。相關研究報告SARSCoV-2 感染除了呼吸道癥狀外還存在神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，鐘南山團隊研究表明在全國范圍內(nèi)的1099 例確證患者中頭痛比例13.6%[4]；同時有研究表明新冠病毒感染重癥患者伴有神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，表現(xiàn)為急性腦血管疾病和意識不清[29]；復方共同作用富集的通路包含神經(jīng)系統(tǒng)相關通路Serotonergic synapse（5-羥色胺能突觸）、GABAergic synapse（GABA 能突觸），這也反映復方對于神經(jīng)系統(tǒng)的干預保護作用，特別是對于神經(jīng)學標志物的影響，與神經(jīng)系統(tǒng)的功能性相關聯(lián)。復方干預保護神經(jīng)系統(tǒng)，對于新冠感染的患者具有良好的治療作用和緩解癥狀的作用，特別是對重癥患者有安神作用，有益于恢復元氣。

圖7 復方藥材歸經(jīng)圖

圖8 復方藥材藥味網(wǎng)絡圖

免疫調(diào)節(jié)以及抗炎癥風暴調(diào)節(jié)。SARS-CoV-2感染后導致強烈的炎癥免疫反應，特別是一周后發(fā)生炎性介質(zhì)風暴，免疫功能亢奮和炎癥介質(zhì)釋放，實驗室檢測一般為CRP、TNF 和IL-6 指標升高，進一步導致病情惡化并且出現(xiàn)多器官衰竭和急性呼吸窘迫綜合癥，并且是輕癥轉(zhuǎn)化為重癥的重要時間軸點。復方共同調(diào)控涉及到Linoleic acid metabolism（亞油酸代謝），Arachidonic acid metabolism（花生四烯酸代謝），特別是Arachidonic acid metabolism（花生四烯酸代謝），其主要用于合成炎癥介質(zhì)，并且介導炎癥因子的產(chǎn)生如單核細胞趨化蛋白-1、腫瘤壞死因子、白介素等，通過抑制花生四烯酸代謝通路，從而達到平衡炎癥介質(zhì)，緩釋炎癥細胞風暴[30]。

圖9 復方藥材藥性網(wǎng)絡圖

圖10 藥材歸經(jīng)、藥味和藥性的百分比堆積柱狀圖

內(nèi)分泌調(diào)節(jié)以及性激素調(diào)控。復方共同調(diào)控涉及到內(nèi)分泌調(diào)節(jié)特別是對于性激素調(diào)節(jié)的作用，有利于緩解癥狀達到臨床治療的目的。尤其是對于性激素的調(diào)控，有研究表明新冠感染存在性別差異，將77932 例患者納入薈萃分析，其中男性為41510 例，占比53.3%，男性患病比率高于女性[31]。有多個原因表明新冠感染的性別差異，而最為關鍵的因素是SARSCoV-2 激活S 蛋白的過程中會利用到絲氨酸蛋白酶TMPRSS2，而絲氨酸蛋白酶TMPRSS2是促進男性前列腺癌的關鍵因子，其受到雄性激素的正向調(diào)控[32]。而復方共同調(diào)劑通路中涉及到內(nèi)分泌調(diào)節(jié)，性激素的調(diào)節(jié)通路Ovarian steroidogenesis（卵巢類固醇生成），這對于新冠病毒感染有潛在的治療作用。

能量代謝調(diào)控。中醫(yī)藥通過多成分-多靶點-多通路調(diào)控，辨證治療疾病，而能量代謝通路恰恰體現(xiàn)不同復方的辨證觀和整體觀治療。新冠患者往往會出現(xiàn)多器官損傷，如果患者營養(yǎng)代謝狀態(tài)不良并且不及時干預，對于治療存在不利影響甚至會惡化病情。而在中醫(yī)藥指導下的復方調(diào)節(jié)，不僅起到直接的藥理作用，并且通過多角度治療緩解癥狀，通過能量代謝通路 Endocrine and other factor-regulated calcium reabsorption（內(nèi)分泌和其他因素調(diào)節(jié)鈣的重吸收），Bile secretion（膽汁分泌），Metabolic pathways（代謝通路）以及Retinol metabolism（視黃醇代謝），具體來講是為細胞供能并且保護心肌細胞。

藥物代謝。復方共同調(diào)控通路涉及到藥物代謝，這對于復方的藥理吸收以及發(fā)揮作用起著輔助作用，并且與上述PPI 蛋白互作網(wǎng)絡的子模塊相呼應，子模塊中細胞色素之間存在關聯(lián)，特別對于細胞色素P450是藥物代謝過程的關鍵酶，這利于復方發(fā)揮藥理作用，從而達到臨床治療作用[33]。

其他通路。對于其他通路，涉及到成癮性相關的通路，臨床上未報到對復方產(chǎn)生依賴性，并且也無出現(xiàn)成癮性相關的副作用，因為復方起到神經(jīng)保護作用，對于中樞神經(jīng)有影響作用，可能復方共同調(diào)控存在潛在的鎮(zhèn)痛作用，目前也無相關的研究報告，鎮(zhèn)痛作用也只是復方共同作用的潛在可能性，需要進一步進行實驗分析驗證。

同時復方4、復方5涉及到與Angiotensin-converting enzyme（血管緊張素轉(zhuǎn)化酶）蛋白相關的通路調(diào)節(jié)，而ACE2 是SARS-CoV-2 病毒的功能受體，在SARSCoV-2 感染的病人中存在ACE2 的高表達[3]。而復方4和復方5 有直接調(diào)控涉及到ACE2 的通路——Reninangiotensin system（腎素-血管緊張素系統(tǒng)），通過調(diào)控平衡ACE與ACE2蛋白達到治療目的。

對于6種復方理論分析、實驗以及臨床驗證，證明“三藥三方”具有治療新冠病毒的藥理作用。化濕敗毒方全方由14 味中藥組成，其適用于輕型、普通型和重型患者治療，臨床上發(fā)揮綜合治療，可明顯縮短核酸轉(zhuǎn)陰時間和住院時間；該方對于新冠病毒感染的小鼠模型，可降低肺組織病毒載量30%，在對該方進行生物信息研究發(fā)現(xiàn)，該方表現(xiàn)與病毒相關蛋白有結(jié)合力，同時表現(xiàn)出免疫炎癥相關的信號通路調(diào)節(jié)，另外化濕敗毒顆粒獲得獲臨床試驗批件[5]。在金銀潭醫(yī)院75 例重癥患者治療效果觀察中，其CT 診斷的肺部炎癥和臨床癥狀明顯改善，住院時間以及核酸轉(zhuǎn)陰時間平均縮短3 天；對將軍路街衛(wèi)生院210 例普通型患者臨床觀察，東西湖方艙醫(yī)院894例輕型和普通型（中藥化濕敗毒方組452例）臨床療效觀察，化濕敗毒方在核酸轉(zhuǎn)陰和癥狀改善方面有顯著差異，同時對服用化濕敗毒方的患者進行肝腎功能追蹤檢測，未發(fā)現(xiàn)與藥物相關的不良反應[5]。

清肺排毒湯全方由21味中藥組成，其功能在于清熱化濕、宣肺透邪和健脾化飲，適用于輕型、普通型、重癥、危重型患者治療。在網(wǎng)絡藥理學的研究分析下，清肺排毒湯起到免疫、炎癥通路調(diào)節(jié)，并且對于干擾病毒的復制以及影響病毒蛋白相互作用[34]。在四川省16所單位收集的98例新冠患者資料中，輕型54例、普通型33 例和重型及危重型11 例均服用清肺排毒湯，檢測臨床癥狀和實驗室指標檢查，治療9天后的總有效率達92.09%，其中痊愈率41.13%，顯效率為26.92%，有效率為24.04%，不良反應發(fā)生率為0.07%[35]。在截至2 月5 日的清肺排毒方應用統(tǒng)計中，214 例確診患者的總有效率達90%，其中60%以上患者癥狀和影像學改善明顯，30%患者癥狀平穩(wěn)且無加重[36]。在山西133 例確診患者中，103 例患者服用清肺排毒湯，臨床癥狀改善明顯，發(fā)熱癥狀3天全部消失，6天治療之后，肺部CT 病灶的吸收非常明顯；同時山西省548例疑似患者中，187例使用清肺排毒湯核酸轉(zhuǎn)陽率為5.35%（10 例），未使用清肺排毒湯核酸轉(zhuǎn)陽率為34.17%（123 例）[37]。在截至 3 月 23 日，在 66 個定點單位的1265 例病例觀察中，已經(jīng)有1241 例治愈出院，另外對于57 例重癥患者進行臨床觀察，無1 例轉(zhuǎn)為危重癥，有42 例（占73.7%）患者治愈出院，同時未見肝腎損傷[38]。在湖北省第三人民醫(yī)院回歸性研究中，與單純抗病毒藥物對比，清肺排毒湯加減方聯(lián)合抗病毒藥物能顯著縮短COVID-19 肺部CT 好轉(zhuǎn)時間、臨床癥狀好轉(zhuǎn)時間及患者住院時間[39]。

宣肺敗毒方全方由13味中藥組成，該方可縮短新冠患者新冠肺炎患者臨床癥狀消失時間、平均住院天數(shù)、體溫復常時間等，可以在一定程度上阻止由輕癥和普通型轉(zhuǎn)為重型；同時網(wǎng)絡藥理學分析表明該方通過調(diào)控病毒感染，免疫炎癥，能量代謝等實現(xiàn)治療[5,40]。在湖北省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院、武漢市中醫(yī)院等單位開展的120 例新冠患者宣肺敗毒方對照試驗，宣肺敗毒方（70例）與對照組（50例）研究對照顯示，宣肺敗毒方與對照組相比其淋巴細胞恢復提高17%，同時臨床治愈率提高22%[5]。同時在江夏方艙里280 例新冠患者臨床觀察中，未出現(xiàn)重癥轉(zhuǎn)化情況，說明宣肺敗毒方降低病危率有積極作用。

金花清感顆粒全方由12味中藥組成，其功效表現(xiàn)為疏風宣肺、清熱解毒，適用于輕癥患者，具體表現(xiàn)為縮短退熱時間，對于淋巴細胞、白細胞復常率有提高作用，同時降低重癥轉(zhuǎn)化率；在臨床觀察中，123 例患者中，金花清感顆粒顯著減輕輕型患者的發(fā)熱、咳嗽、乏力、咳痰臨床癥狀，并且能夠緩解患者心理焦慮；在武漢102輕癥和普通型病例中，轉(zhuǎn)重癥率明顯降低，僅為11.8%；在北京天佑醫(yī)院開展的80 例對照研究，使用該方的患者相比對照組的核酸轉(zhuǎn)陰時間降低2 天半[5]。同時網(wǎng)絡藥理學理論分析出，該方通過病毒、細菌、免疫調(diào)節(jié)及炎癥反應來達到治療效果。針對湖北省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院急診123 例新冠感染患者，通過常規(guī)治療對照組與金花清感顆粒組進行對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)金花清感顆粒能夠顯著減輕新冠感染的臨床癥狀如發(fā)熱、咳嗽、乏力、咳痰，但同時治療組表現(xiàn)較高的不良反應率32.93%（27 例），均為腹瀉[41]。在首都醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院的46例新冠感染病例中，19例使用連花清瘟膠囊、27 例使用金花清感顆粒，并且配合西醫(yī)治療手段，最終所有患者癥狀逐漸改善好轉(zhuǎn)出院，基于本研究未進行分組研究中醫(yī)藥治療新冠肺炎，無具體對比反映中西醫(yī)的具體作用，但該研究能夠積極反映連花清瘟膠囊和金花清感膠囊對新冠肺炎的治療作用[42]。

連花清瘟膠囊是治療感冒的常用中成藥，能夠減少輕型、普通型轉(zhuǎn)重癥的發(fā)生，并且有利于核酸轉(zhuǎn)陰的時間；同時該方可以通過關鍵分子從而達到激活的抗病毒、抗炎等協(xié)同作用減輕新冠肺炎的癥狀；鐘南山科研團隊發(fā)現(xiàn)該方能顯著抑制SARS-CoV-2 在細胞中的復制，該方處理后細胞內(nèi)病毒顆粒表達顯著減少，并能顯著抑制SARS-CoV-2感染細胞所致的TNF-a、IL-6、MCP-1和IP-10炎癥因子的基因過度表達，且具劑量依賴關系，證實了該方的抗病毒效果[5,43]。臨床研究表明，連花清瘟膠囊能縮短新冠感染患者核酸轉(zhuǎn)陰時間、發(fā)熱時間同時明顯緩解臨床癥狀[44]。單獨使用連花清瘟膠囊治療輕癥、普通型患者有效率達到100%，連花清瘟膠囊聯(lián)合阿比多爾有效縮短患者治療時間以及住院時間[45]。與113 例對照組相比，138 例連花清瘟膠囊聯(lián)合常規(guī)治療提高了患者主要癥狀消失率，同時對于次要癥狀有改善作用[46]。連花清瘟膠囊通過體外實驗驗證對SARS 病毒的治療指數(shù)為40.33，半數(shù)抑制濃度為3.63 mg·mL-1，同時通過動物實驗驗證其能夠提高免疫功能，并且具有延長小鼠咳嗽潛伏期、化痰和抗炎的作用[47]。

血必凈注射液由5 味中藥提取物組成，表現(xiàn)出體外抗病毒作用，并且能夠顯著降低炎癥風暴的發(fā)生，同時還具有抗血栓的作用，此前在臨床中710 名重癥肺炎患者，隨機對照顯示血必凈注射液聯(lián)合常規(guī)治療28 天病死率降低8.8%，縮短4 天的ICU 住院時間；同時32 家醫(yī)院參與的156 例重型、危重型新冠肺炎患者的研究顯示，在基礎治療加上血必凈注射液后效率較高[5,48]。在血必凈注射劑治療新冠肺炎的證據(jù)基礎和研究前瞻，共有10篇血必凈注射劑治療膿毒癥的隨機臨床對照的系統(tǒng)評價，最新1 篇Meta 分析評價血必凈注射劑聯(lián)合常規(guī)治療膿毒癥的安全性與有效性，評論表明在1144名膿毒癥患者中，聯(lián)合血必凈注射劑可降低體溫、白細胞計數(shù)、急性生理與慢性健康評分（APACHE Ⅱ）和28 天病死率[49]。在東南大學附屬醫(yī)院牽頭展開血必凈注射劑治療膿毒癥療效的多中心盲法隨機對照臨床研究中的1810名膿血癥，與常規(guī)治療相比聯(lián)合血必凈注射劑可降低患者28 天病死率（P-value＜ 0.001）[50]。同時93 家二甲以上醫(yī)院開展血必凈注射劑臨床安全性檢測，31913 名使用血必凈注射劑的患者的不良反應率為0.30%（96 例），屬于偶然級別均為已記載不良反應[51]。針對湖北醫(yī)藥學院附屬東風醫(yī)院隔離病房的44例新冠感染患者，對照組為常規(guī)治療，觀察組為血必凈注射劑聯(lián)合常規(guī)治療，結(jié)果顯示血必凈注射劑治療普通型新冠感染肺炎可提高療效并且促進肺部感染病灶吸收，同時安全性良好（不良反應均為個例），但對核酸轉(zhuǎn)陰率以及炎癥指標改善不明顯[52]。另外血必凈注射劑臨床不良反應主要表現(xiàn)為呼吸系統(tǒng)損害、過敏性休克全身性損害和心血管系統(tǒng)損害。

從中醫(yī)藥角度分析新冠病毒感染，其病理特點是重濁黏膩、病程纏綿和病情多變，核心病因是濕毒郁閉，主要病位是肺和脾，其屬于寒濕疫的范疇，同時出現(xiàn)不同臟腑的損害，臨床上新冠感染與心、肝、腎和大腸器官存在關聯(lián)性，這與病毒通過ACE2 受體攻擊人體的心臟、食道、腎、膀胱和回腸等器官相吻合，同時符合新冠肺炎尸檢報告。“三藥三方”治療新冠病毒體現(xiàn)中醫(yī)分期及辨證治療觀點，從中醫(yī)角度上講初期寒濕侵犯肺衛(wèi)、中期疫毒內(nèi)陷蘊肺、重癥期毒擾營血，內(nèi)閉外脫以及恢復期邪去正虛，同時以治療觀點在不同時期的體現(xiàn)也不相同，初期以宣肺透表和健脾化濕為主、中期以以清熱解毒，化痰平喘為主，佐以通腑泄?jié)嶂贰⒅匕Y期以清營解毒，涼血開竅，化痰平喘為主，佐以益氣回陽救急之品以及恢復期以扶正祛邪為主。而“三藥三方”中復方3、復方4 和復方5 用于輕癥初期，其以宣肺透表和健脾化濕為主，復方6 適用于重癥，其以清營解毒，涼血開竅，化痰平喘為主，佐以益氣回陽救急之品，同時復方1 和復方2 為通用方，其治療需因人和時期而異，一般用于新冠肺炎輕癥、普通型和重癥患者，同時在危重患者可結(jié)合患者的實際情況使用，其總體表現(xiàn)祛濕的中醫(yī)核心治療觀點。

復方1 到復方5 均以肺經(jīng)為主，同時出現(xiàn)脾經(jīng)和肝經(jīng)，這符合中醫(yī)角度下新冠病情的病位點，合理地針對病因以及病機，而對于復方6不同與其他復方，其主要功能是緩減炎癥因子風暴，主要適用于熱、毒、瘀內(nèi)蘊的辨證，其歸經(jīng)則以肝經(jīng)和心經(jīng)為主，以脾經(jīng)為輔，重癥病人伴隨著高熱、喘憋、膿毒血癥、器官衰竭等邪氣入心、肝，故歸經(jīng)以肝經(jīng)和心經(jīng)為主。同樣地，復方1、復方2和復方6以溫性藥為主，而復方3、復方4和復方5則以寒性藥為主，以苦寒去內(nèi)熱，而新冠肺炎主要屬于“濕毒化熱”，并不是濕熱入侵而化熱，應該在臨床上注重“濕”的變化，并不是過早和過多的清熱，這也反映復方不僅以寒性藥去熱，并且有以溫性藥為主的復方注重“濕”的變化，實現(xiàn)辨證論治的治療原則。而從藥味角度上講，復方均以苦味、辛味、甘味藥為主，以苦寒去內(nèi)熱，其發(fā)揮解毒化濕和輕熱平喘的功效。

“三藥三方”多重點作用于脾經(jīng)和肺經(jīng)，初期和中期復方重點作用于肺經(jīng)和胃經(jīng)，重癥期復方重點作用于肝經(jīng)和心經(jīng)，這符合解毒化濕、輕熱平喘的核心治療觀點。新型冠狀肺炎病位在肺，但隨著病情發(fā)展逐漸至脾、胃，從運化水谷精微角度講，《內(nèi)經(jīng)》有言“飲入于胃，游溢精氣，上輸于脾，脾氣散精，上歸于肺，通調(diào)水道，下輸膀胱。”水谷精微的正常功能在于脾的運化和肺的行水相關，“三藥三方”整體重點作用于脾經(jīng)和肺經(jīng)在于維持水谷精微的正常功能，阻止病情的惡化，同時體現(xiàn)中醫(yī)“脾為后天之本”、“肺為相傅之宮，治節(jié)出焉。統(tǒng)輯之氣，無經(jīng)不達，無臟不轉(zhuǎn)，是乃肺之充，而肺乃氣之主也”防治思想。初期燥邪傷陰、表濕郁肺，中期疫毒陷肺、肺燥脾濕，故初期和中期以宣肺透表和健脾化濕為主，宣肺氣、通腑泄熱、啟脾胃，同時由于脾和胃相表里，初期和中期復方重點作用于肺經(jīng)和胃經(jīng)。重癥危重期內(nèi)閉外脫、疫毒蘊肺，出現(xiàn)高燒、神志不清等邪氣入心，出現(xiàn)一系列典型的少陽證表現(xiàn)，邪犯少陽肝膽，樞機不利，經(jīng)氣不暢，故重癥危重期需回陽救逆、啟閉固脫，即重癥期復方重點作用于肝經(jīng)和心經(jīng)。

在中醫(yī)治病求因、辨證論治、已病防變和正氣存內(nèi)的原則下，6種復方的性、味、歸經(jīng)均符合解毒化濕、輕熱平喘的核心治療觀點，在改善病癥的同時，縮短患者的退熱時間和痊愈時間，降低輕癥轉(zhuǎn)重比例，同時提高中性粒細胞等生理指標，并且促進康復減少后遺癥，去除余邪氣和扶助正氣，改善癥狀和提高免疫能力。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡藥理學和分子對接對“三藥三方”的化學成分、核心靶點和性味歸經(jīng)進行系統(tǒng)性、整體性分析，從多成分-多靶點-多通路的協(xié)同作用角度初步闡述復方的藥理機制，分析各自復方藥理作用的異同，從分子水平角度初步解釋“三藥三方”的藥理特證，從中醫(yī)辨證治療以及分期治療的觀點分析“三藥三方”的藥理作用特點的異同，解釋中醫(yī)藥在治療新冠的辨證治療、分期觀點，同時利用現(xiàn)代藥理分析方法，探究“三藥三方”治療新冠肺炎的分期治療和辨證治療中醫(yī)理念，其為COVID-19 的中醫(yī)藥治療提供了科學理論依據(jù)。同時介于對SARS-CoV-2 認識的局限性，其感染機制和治療機制尚存不足，以及需要進一步實驗探究網(wǎng)絡藥理學的理論分析觀點，同時對于復方調(diào)控功能中的主次關系也存在認識性的不足。