基于網絡藥理學方法探討尿毒靈復方治療糖尿病腎病的作用機制

黃樂宇 ，袁小紅 ，2＊＊

（1. 廣州中醫藥大學第二附屬醫院 廣州 510120；2. 廣東省中醫院科學院 廣州 510006）

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是比較典型的糖尿病微血管并發癥，其發病機制復雜，多種致病因素相互影響，其主要成因是患者的血糖持續升高、腎臟微血管發生病變而引起腎小球硬化，同時更是導致患者產生終末期腎病的重要原因[1]。其基本病理特征是腎小球毛細血管基底膜增厚，系膜基質增生與腎小球硬化，臨床主要表現為蛋白尿、高血壓、水腫以及不同程度的腎功能損害[2]。隨著糖尿病的發病率不斷升高，DN 的發病率也呈上升趨勢。西方國家DN的發病率，占據了終末期腎病的近44%[3]。現代西醫治療DN，基本以降糖、調脂，配合應用血管緊張素轉換酶抑制劑（angiotensin converting enzyme inhibitor，ACEI）、血管緊張素受體拮抗劑（angiotensin receptor blocker，ARB）類藥物進行冶療[4]，但是不能完全阻斷DN 的發生和發展，中醫藥在治療DN 上有其獨特的優勢，能夠顯著改善患者癥狀，有效減少尿蛋白，改善腎功能，從而延緩DN進程[5]。

中藥復方尿毒靈是廣東省中醫院黃春林教授長期以來治療糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)、慢性腎衰竭(chronic renal failure，CRF)、腎纖維化的有效方劑。該方為院內制劑，主要由黃芪、大黃、三七、淫羊藿等中藥組成[6]，臨床研究表明該方可降低DN 患者的尿蛋白、尿白蛋白排泄率，同時可在一定程度上改善糖脂代謝紊亂，起到保護腎臟，延緩DN 和腎纖維化進程的作用[7]。中藥治療疾病是通過多成分作用于多靶點的錯綜復雜的過程，尿毒靈復方治療DN 也是如此，前期的研究結果表明，尿毒靈能夠抑制高糖誘導的腎小球系膜細胞增殖[8]，阻止甚至逆轉腎小管上皮細胞的轉分化作用[6]，但這只是尿毒靈作用機制的一小部分，尚需要不斷地挖掘，深入研究。

網絡藥理學作為一門結合系統生物學及計算機技術的新興學科，目前已經廣泛應用于中藥復方研究，多數復雜疾病都與復雜的生物網絡緊密相關，單靶點的干預策略對此多有不足，因此，以網絡為特點的復雜病證適宜于“多靶點”的組合干預[9]。為了更全面地探討尿毒靈的作用機制，本研究運用網絡藥理學的方法，通過TCMSP數據庫篩選出尿毒靈中可能的活性成分，并將目標成分對應的靶點與DN 疾病靶點進行匹配，從而檢索出尿毒靈治療DN 的關鍵靶點，構建成分-靶點網絡，預測尿毒靈的活性成分及作用的靶點和通路，為進一步的作用機制研究提供依據。

1 方法

1.1 糖尿病腎病差異性表達基因的收集

應用 GeneCards（https://www.genecards.org/）、TTD數據庫（http://systemsdock. unit. oist. jp/iddp/home/index）、CTD 數據庫（http://ctdbase.org/）、DisGeNET 數據 庫 (http://www. disgenet. org/web/DisGeNET/menu/search)、DrugBank 疾病靶點篩選數據庫（https://www.drugbank.ca/），以“diabetic nephropathy”為檢索詞獲取DN 靶點。刪除重復冗雜的基因和假陽性基因，合并5個數據庫所獲得的數據，將最后篩選出的靶點基因全稱輸入DrugBank獲取基因簡稱和Uniprot ID。

1.2 尿毒靈復方中化學成分及預測靶點的收集

使用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology，TCMSP）選擇與尿毒靈有關的化學成分，結合文獻報道，以藥物口服生物利用度（OB）≧30%，類藥性（DL）≧ 0.18 作為篩選條件[10-12]。借助蛋白質數據庫（Uniprot），限定物種為“人”，將收集到的靶點蛋白名稱轉換成基因的ID名稱。

1.3 “尿毒靈化學成分-作用靶點”網絡的構建

將尿毒靈的預測靶點與DN 差異性表達基因取交集，所得交集靶點即為尿毒靈作用于DN 的預測靶點。利用Cytoscape 軟件構建中藥化學成分-作用靶點網絡，探究預測靶點與化學成分之間的相互作用。

1.4 PPI 網絡的構建及關鍵靶點篩選

在 STRING 數據庫（https://string-db.org/）中分析蛋白質和蛋白質之間的相互作用，導入交集靶點，得到尿毒靈作用于DN 的靶蛋白相互作用網絡。利用Cytoscape 軟件構建網絡圖并對其進行分析，以自由度（Degree）、介數（Betweenness）、中心性（Closeness）都大于平均值作為關鍵靶點的篩選條件。

1.5 GO分析和KEGG通路富集分析

將交集靶點導入DAVID 6.8 數據庫，限定物種為“Homo Sapiens”，設定閾值P＜ 0.01，進行GO 生物過程富集分析。設定閾值P ＜0.05，進行KEGG 通路富集分析。GO 富集分析結果以柱狀圖形式進行可視化展示，KEGG通路富集以氣泡圖的形式進行可視化展示。

1.6 整體研究思路

研究過程見圖1。

2 結果

2.1 DN相關差異性表達基因檢索結果

在 CTD、TTD、DISGENET 3 個 數 據 庫 中 以“diabetic nephropathy”為檢索詞獲取 DN 靶點，在DrugBank 數據庫中通過反向搜索藥物治療疾病靶點，排除未經驗證的靶點，分別獲得靶點36 個、17 個、52個、475 個，刪除重復冗雜的基因共獲得基因靶點528個，將528個疾病靶點與GeneCard 搜索得到的2391個疾病靶點取交集，共獲得211 個疾病靶點,將靶點信息進行基因名和Uniprot ID的標準化。

2.2 候選化合物及靶點的篩選

收集尿毒靈中所含的化合物，在TCMSP 中，根據篩選閾值，共得到候選化合物67 個，其中10 個候選化合物無靶點，重復靶點僅保留1個，將靶點信息進行基因名標準化，共獲得152個化合物靶點。

2.3 成分-靶點網絡構建及分析結果

圖1 整體研究思路

表1 尿毒靈中篩選出的與DN靶點相關的39個候選化合物成分

利用Bioinformatics & Evolutionary Genomics 平臺將化合物基因靶點與疾病基因靶點進行匹配并繪制韋恩圖（圖2），得到46個共同靶點基因，對應尿毒靈復方中的39 個候選化合物，化合物信息見表1。利用Cytoscape 作圖軟件繪制中藥化合物-靶點作用網絡，網絡中有85 個節點（其中化合物節點39 個，靶基因節點46 個）和323 條邊（圖3）。對靶點網絡進行分析，節點代表尿毒靈中的化學成分與潛在作用靶點；邊展現了化學成分和其作用靶點之間的相互聯系，根據網絡關系圖篩選出尿毒靈作用于DN 的目標化合物。以度值大小排序，前10 位化合物見表1，分別為槲皮素（quercetin），其次為山柰酚（kaempferol），β-谷甾醇（beta-sitosterol），木 犀 草 素（luteolin），7-O-methylisomucronulatol，豆甾醇（stigmasterol），蘆薈大黃素（aloe-emodin），異鼠李素（isorhamnetin），脫水淫羊藿素（Anhydroicaritin），C-Homoerythrinan,推測這些化合物可能是尿毒靈治療DN的關鍵化合物。

圖2 疾病靶點與化合物靶點基因的匹配

2.4 “尿毒靈-DN交集靶點”PPI網絡的構建及關鍵靶點篩選

中藥治療疾病的機制是一個復雜的過程，不僅僅是通過直接地作用于信號通路，在靶點和通路之間可能存在一定程度的信號轉換。因此，對交集靶點進行PPI 網絡分析，以探究靶點之間相互作用的關系。如圖4所示，網絡中有45個靶點發生蛋白相互作用（1個靶點未發生蛋白相互作用），341 條邊表示蛋白的相互作用。利用Cytoscape 軟件對網絡進行分析，網絡中節點的平均自由度為15.2，平均介數為0.019，平均中心度數0.655，3 個數值均超過平均值的靶點有13 個（表2），推測這些靶點可能是尿毒靈治療DN 的關鍵靶點。

2.5 GO功能分析

選取P 值排名前10 的相關功能信息（表3、圖5）。結果顯示尿毒靈活性成分主要富集在應對藥物反應、一氧化氮生物合成過程的正調控、ERK1和ERK2級聯的正向調節、細胞增殖的正向調控、以DNA 為模板轉錄的正向調節、RNA 聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正向調控、基因表達的正向調控、對雌二醇的反應、凋亡過程的負調節、成纖維細胞增殖的正向調控等生物過程中；分子功能方面參與了酶結合、蛋白質同二聚體活性、藥物結合、轉錄因子結合類固醇激素受體活性、染色質結合、細胞因子活性等；與細胞外間隙、質膜、胞外區等細胞組成相關。

圖3 化合物-靶點網絡圖

圖4 尿毒靈治療DN靶蛋白PPI網絡圖

表2 尿毒靈治療DN的13個可能關鍵靶點的基本信息

2.6 KEGG通路富集分析結果

經過KEGG 通路富集分析，顯示該46 個靶點顯著富集在78 條通路上（P＜ 0.05），其中與DN 相關的前5條通路分別為HIF-1 信號通路、TNF 信號通路、PI3KAkt 信號通路、MAPK 信號通路、VEGF 信號通路等（圖6），其中，PI3K-Akt信號通路的富集基因數最多，為12個基因；富集程度最高的通路為HIF-1 信號通路，富集的基因數為9 個，提示尿毒靈可能是通過以上多條通路作用于DN。

表3 藥物-疾病交集基因具有的功能信息

3 討論

DN 是糖尿病嚴重的并發癥之一，據估計，糖尿病導致的終末期腎病（end-stage renal disease，ESRD）占全世界發病患者的30%-47%[13]。其發病機制復雜，主要涉及血流動力學改變、細胞凋亡、炎癥刺激、氧化應激等各個方面[14]。近年來，中醫藥在防治DN 發生發展、改善腎功能惡化等方面均取得了較大進展。

廣東省名老中醫黃春林教授認為腎虛血瘀是DN發病的核心病機，腎主水液，腎臟蒸騰氣化作用的正常發揮取決于腎陽充沛與否，扶助腎元方可療其根本。針對DN 基本病機，由黃芪，大黃，淫羊藿，三七等中藥組成了尿毒靈方劑應用于臨床，方中黃芪配伍淫羊藿共為君藥，既能補氣健脾，又行溫腎助陽除濕之效。臣藥大黃活血通腑瀉濁，三七化瘀生新，以上四味藥合用，共奏益氣助陽、化瘀泄濁之功。嚴雪[7]對尿毒靈顆粒對于早中期DN 患者的臨床療效進行了初步的觀察與探討，結果發現尿毒靈顆粒可以顯著改善早中期DN 患者的中醫臨床癥狀，能夠降低DN 患者的尿蛋白、尿白蛋白排泄率，并且在一定程度上改善糖脂代謝紊亂，起到延緩DN進展的作用。李顯波[15]在尿毒靈對DN 腎功能不全的臨床和實驗研究中發現，經尿毒靈治療后，DN 腎功能不全患者的臨床癥狀改善明顯，血肌酐和尿素氮水平降低，尿毒靈治療終末期DN療效確切，有效率達到86.67%。動物實驗研究表明尿毒靈可明顯改善DN 大鼠的癥狀，降低血肌酐和尿素氮，糾正脂質代謝紊亂，減少蛋白尿的排泄，改善血液高凝狀態的作用。還能夠抑制腎組織中細胞外基質的積聚，減少體內尿素氮和肌酐的來源，延緩腎功能惡化的進程等[16-18]。細胞實驗結果表明，尿毒靈對高糖刺激的腎小球系膜細胞以及對TGF-β1 誘導的HK-2細胞均具有一定的保護作用。

圖5 GO富集分析柱狀圖

DN 的發病機制錯綜復雜，而尿毒靈的化學成分也很復雜，因此，其療效是多成分綜合作用的體系。網絡藥理學作為一門系統性的學科，可以構建虛擬的多對多的復雜網絡體系，其以整體性、系統性、藥物相互作用的角度對復方中各中藥進行剖析，與中醫藥多成分、多靶點的特點不謀而合，是研究中藥復方物質基礎的有力輔助篩選工具。為了更深入地探討尿毒靈的作用機制及藥效物質基礎，本實驗以網絡藥理學的方法進行虛擬篩選，探討尿毒靈治療DN 的藥效成分和作用機制，為進一步的研究提供方向。

圖6 尿毒靈治療DN關鍵靶點參與的通路富集信息

構建尿毒靈及DN的交集靶點PPI網絡，對網絡進行分析，得到 VEGFA，TP53，NOS3，TNF，RELA，IL-1β，IL-6，PPARG，CASP3，EGFR，PTGS2，AR，SOD1 等13 個關鍵靶點。據有關研究報道，VEGFA 在DN 動物腎臟中處于高表達的水平，干擾其表達后腎功能得到明顯改善[19]。microRNA-770-5p 通過靶向 TP53 調節凋亡抑制劑1 而調節足細胞凋亡，進而參與DN 的發展[20]。也有研究初步發現，NOS3 基因多態性可能與DN 易感性有關[21]。相關臨床研究發現，DN 組患者的TNF-α顯著高于 T2DM 組，推測 TNF-α可能與 DN 的發生發展有關[22]。在高糖刺激下糖尿病大鼠腎小球系膜細胞的p65，IL-1β，IL-6 增加[23-24]。過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferators-activated receptors，PPAR-γ）的蛋白含量及mRNA 水平變化在DN 患者血清中明顯降低，其下調與TGF-β1 水平的上調具有明顯負相關性，說明可能參與了DN 的發病進程[25]。報道發現，上調miR-424 可以改善 DN 癥狀，通過降低Caspase-3 和bax 的表達水平以及增加bcl-2 的水平，顯著降低組織細胞的凋亡率[26]。徐政[27]發現，表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）通過介導氧化應激與內質網應激水平來調控DN。前列腺素內過氧化物合酶2（prostaglandin endoperoxide synthase 2，PTGS2）是前列腺素生物合成中的關鍵酶，前列腺素E1 能夠改善早期DN 患者血管內皮功能[28]。睪酮通過雄激素受體（androgen receptor，AR）改善波動性高糖導致人臍靜脈內皮細胞損傷的作用減弱[29]。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是一種廣泛存在于生物體中的抗氧化因子，對抗氧化應激有著關鍵作用。研究發現DN 患者SOD 明顯低于健康對照組，SOD在輔助診斷2型DN方面具有較高的靈敏度和特異性，可將SOD 作為臨床早期診斷2型DN的輔助指標[30]。

度值是度量節點局部中心性的重要參數，指節點的直接鄰節點數目，認為一個節點的直接相連的節點數目越多，該節點的影響力就越大，用該參數衡量節點重要性簡單直觀。其中，中心節點為少量連接度很高的節點。它們作為網絡樞紐往往參與重要的生命活動，同時發揮著關鍵的生物學功能，對維系相互作用網絡的穩定性起至關重要的作用[31]。從尿毒靈的成分-靶點網絡關系圖中，推測出復方中度值最高的前10個化合物依次為槲皮素，山奈酚，β-谷甾醇，木犀草素，7-O-methylisomucronulatol，豆甾醇，蘆薈大黃素，異鼠李素，脫水淫羊藿素等，說明這些化合物可能是尿毒靈治療DN 的潛在活性成分。其中的大多數成分在腎病的治療方面已用文獻報道，如王艷橋[32]發現槲皮素可以抑制高糖培養狀態下腎小球系膜細胞（glomerular mesangial cells，GMCs）的增殖，并具有時間、劑量依賴效應。山奈酚可以抑制GMCs 異常增殖與細胞外基質（extracellular matrix，ECM）過度分泌，進而延緩了腎小球硬化的進程，起到治療DN 的作用[33]。木犀草素能夠通過上調Nrf2 激活抗氧化酶SOD、HO-1、γ-GCS 的表達，對 STZ 誘導的 DN 小鼠發揮腎臟保護作用[34]。另有文獻報道，用豆甾醇處理過的糖尿病大鼠，血清葡萄糖水平、尿酸、肌酐和血脂水平上產生顯著的衰減；此外，超氧化物歧化酶、谷胱甘肽和脂質過氧化反應水平均有改善，且腎臟中晚期糖基化產物的形成也明顯減少[35]。異鼠李素能夠劑量依賴性抑制糖尿病大鼠腎組織中NF-κB 系統的過度活化，降低炎癥因子 TNF-α、IL-1β、IL-6、ICAM-1 和 TGF-β1 的蛋白和mRNA 水平[36]。對所得的成分-靶點網絡進行分析，結合文獻報道，槲皮素可通過抑制NF-κB 激活降低炎癥環境中IL-1β的含量[37]。山奈酚能夠通過靶向VEGF 從而抑制人視網膜內皮細胞增殖[38]，在β-谷甾醇和豆甾醇對小鼠急性結腸炎的治療作用研究中，馮思敏等發現豆甾醇和β-谷甾醇顯著降低結腸組織炎癥因子IL-6 和環氧合酶COX-2 的mRNA 表達，另外豆甾醇還能顯著抑制IL-1β的表達[39]。木犀草素能夠通過降低IL-6、TNF-α及p65 蛋白表達水平來降低大腸埃希菌對呼吸道上皮細胞的毒性[40]。蘆薈大黃素通過抑制Notch-1/AKT/NF-κB 信號通路從而誘導胃癌SGC-7901 細胞凋亡[41]。本文的研究結果與文獻報道結果基本一致，說明該預測的結果可信程度比較高，其預測結果可作為進一步研究的思路和方向。

對交集靶點進行GO 功能和KEGG 通路富集分析，結果顯示，尿毒靈對治療DN 的生物過程主要富集在對一氧化氮生物合成過程的正調控，成纖維細胞增殖的正向調控等。作用的信號通路主要涉及HIF-1信號通路、TNF 信號通路、PI3K-Akt 信號通路、MAPK信號通路、VEGF 信號通路等。據文獻報道，高糖環境下HIF1α-KIM1 信號通路能夠通過調控FN、COL-Ⅰ等相關蛋白的表達影響糖尿病腎病腎間質纖維化的發生和發展[42]。黃芪甲苷聯合氯沙坦能通過調控PI3K/Akt/NF-κB 信號通路改善糖尿病大鼠的腎組織損傷狀況，延緩DN 的發生發展[43]。劉桐菊等[44]采用酶聯免疫吸附測定檢測高糖環境下腎系膜細胞上清液中VEGF 的質量濃度，發現各給藥組VEGF 的質量濃度顯著下降，推測糖腎安干預DN 的作用機制可能與降低VEGF質量濃度有關。下一步可以從上述信號通路入手開展相應的實驗研究。

尿毒靈是臨床上治療DN 的有效方劑，但是由于化學成分復雜多樣，其作用機制尚未完全闡明。本研究借助網絡藥理學挖掘出尿毒靈作用于DN 可能的潛在靶點和作用機制，同時也為中藥在治療DN 方面的研究提供更多的參考方向，避免了進一步研究的盲目性。但是該方法也存在一定的局限性，如采用TCMSP數據庫收集藥物成分和對應靶點，庫中的藥物成分信息來源鏈接PubChem 數據庫，靶點信息來源鏈接DrugBank 數據庫，可能存在檢索到的化合物不全、一些數據來源信息無法匹配等問題，并且TCMSP數據庫中的中藥種類只涉及500 種植物藥，尚未擴大到動物藥和礦物藥[45]，且數據庫的信息來源于發表的文獻，因此，對疾病研究得越深入，對處方中中藥及其化合物的研究越多，所篩選得到的結果就越可靠，其準確性與復方的化學成分研究的程度、疾病發病機制、相關靶點的研究等密切相關，因此，尚需對預測靶點通路做進一步的實驗驗證。