反式桂皮醛通過抑制前額皮質IL-1β改善阿爾茨海默病小鼠記憶障礙的作用研究＊

王俐君，李 坤，高 潔，吳永康，盧志園，顧祎寧，王星禹，王 健，張宗奇，徐 穎＊＊

（1. 上海中醫藥大學康復醫學院 上海 201203；2. 上海中醫藥大學基礎醫學院 上海 201203；3. 上海中醫藥大學附屬曙光醫院腦病科 上海 200021）

阿爾茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是全球普遍的神經退行性疾病，嚴重影響患者的認知功能，并且會造成不可逆的記憶喪失，使其喪失自我照顧管理的能力[1-2]。AD 的主要病理特征是胞外β-淀粉樣蛋白（β-amyloid，Aβ）的沉積形成斑塊和胞內tau 蛋白積聚形成的神經纖維纏結[3-4]。近些年來，越來越多地研究認為炎癥在AD 的病理過程中也發揮著重要的作用[5]，在AD 早期，炎癥反應是發揮神經保護的作用，但隨著病程的加劇，會引起炎癥因子的過度產生和腦內的持續炎癥，并加劇神經元和突觸的損傷[6]。因此，將神經炎癥作為AD 的治療靶點是一種很有前景的治療策略。

早老素1/2 條件性雙基因敲除（Presenilin1/2 conditional double knockout，PS cDKO）小鼠是 AD 樣的小鼠模型。PS1 和PS2 基因突變是早發性家族性AD的主要致病原因[7]，這2 種基因編碼的跨膜蛋白具有67%相同的氨基酸序列，只是在N-末端和第六疏水環不同，是γ-分泌酶的亞基，參與β淀粉樣前體蛋白、Notch受體等蛋白的酶解過程[8]。PS cDKO小鼠表現出一系列的年齡依賴的AD樣表型，像突觸功能異常、tau蛋白的高度磷酸化、腦萎縮、認知功能異常和炎癥反應的增加[9-10]。對于炎癥反應，不僅出現在腦中，也會擴散到周圍，這有助于探究炎癥反應在AD 病理過程的發揮的作用[11]。

對于AD 的治療，目前FDA 批準的藥物有美金剛、多奈哌齊、加蘭他敏和利維思明，并且以Aβ和tau蛋白為靶點的疾病修飾治療研究取得的成果有限，目前沒有很強的臨床和實驗依據[12]。慢性炎癥會導致tau 蛋白的過度磷酸化、突觸蛋白丟失進而導致神經元損傷和認知功能受損[13]。以慢性炎癥為作用靶點，尋找防治AD 的天然藥物，為AD 的防治提供新的治療策略。反式桂皮醛（Trans-cinnamaldehyde，TCA）是肉桂油中的主要活性成分，可以發揮抗癌、抗炎、殺菌、保護心臟和抗氧化等作用[14-15]。對于TCA 的神經保護作用，我們之前的研究發現，對于脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）誘導的原代小膠質細胞，TCA 預處理能夠減弱其形態改變、減少一氧化氮和白介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）的釋放、通過縮短誘導型一氧化氮合酶（Inducible nitric oxide synthase，iNOS）mRNA 的半衰期來阻斷LPS 誘導的iNOS 表達，并且對于LPS 刺激的小鼠，TCA 對其的識別記憶和空間參考記憶有改善作用，這是通過改善突觸可塑性、抑制小膠質細胞的激活、降低 iNOS 和 IL-1β的 mRNA 水平，下調 iNOS 的表達和阻斷胞外信號調節激酶1/2（Extracellular signalregulated kinase1/2，ERK1/2）的磷酸化來實現的[16]。另外，對于6月齡的PS cDKO 小鼠，TCA 通過阻斷核轉錄因子-κB（Nuclear factor kappa B，NF-κB）信號通路、抑制小膠質細胞的活化和神經炎癥和改善突觸功能障礙來改善受損的記憶功能[17]。AD 是進行性發展的神經退行性疾病，表現為逐漸惡化的認知功能障礙和行為異常，其中記憶（屬于認知范疇）障礙被認為是主要癥狀[18]。TCA 可以改善6 月齡 PS cDKO 小鼠的記憶功能障礙，對于12月齡的PS cDKO 小鼠的記憶功能障礙是否仍具有改善作用目前尚不清楚。為了檢測TCA改善記憶障礙的治療潛能，本研究進一步探索TCA 對于AD 的防治作用，借助12 月齡的老年PS cDKO 小鼠作為AD 模型小鼠，探討TCA 對小鼠運動功能、學習記憶、空間識別記憶的影響；探討TCA 對突觸蛋白和促炎癥因子的影響來進行機制的探討，為臨床防治AD提供實驗室證據參考。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

對于PS cDKO 小鼠的繁殖和鑒定方法同文獻[7]。攜帶轉基因 Cre，PS1 和 PS2 的基因型為 fPS1/fPS1、PS2-/-的 PS cDKO 小鼠作為 PS cDKO 小鼠；野生型對照小鼠組選用的是遺傳背景、年齡均相同的同窩小鼠（不攜帶 Cre 基因，PS1 和 PS2 的基因型為 fPS1/+、PS2+/+或者fPS1/+、PS2+/-）。所有小鼠均飼養在上海中醫藥大學實驗動物中心SPF 級動物房間，飼養溫度為（22±2）°C，明暗周期為12 h，可自由飲食。對于實驗動物進行的所有操作都遵守倫理規定，經過上海中醫藥大學實驗動物管理和使用委員會的批準。9 月齡的PS cDKO 小鼠和其同窩小鼠隨機分為4 組：野生型組（Wildtype，WT）、野生型 +TCA組（WT+TCA）、模型組（PS cDKO，cDKO）和模型 +TCA 組（cDKO+TCA），每組 15 只。WT + TCA 和 cDKO + TCA 組的小鼠給予含有TCA（240 ppm）的飼料治療，WT 和cDKO 組的小鼠給予普通飼料，共治療90 天。第60 天開始進行行為學測試，行為學測試期間繼續如前給予TCA治療。

1.2 主要儀器及試劑

電子天平（上海光能儀器廠）；電泳儀、電泳槽和轉膜槽（美國Bio-Rad 公司）；化學發光成像儀（上海天能公司）；PCR 儀（瑞士Roche 公司）；酶標儀（美國BioTek 公司）；TCA（Sigma-Aldrich 公司）；BCA 試劑盒（碧云天公司）；N-甲基-D-天冬氨酸受體（N-methyl-D-aspartate Receptor，NMDAR）亞基NR1、磷酸化的鈣/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶II alpha（Phosphorylated-Ca/calmodulin-dependent protein kinases II alpha，pαCaMKII）、β-actin 抗體和 HRP 標記的抗兔二抗（Cell Signaling Technology 公司）；PCR 試劑盒（TaKaRa 公司）；小鼠IL-1βELISA試劑盒（R&D Systems公司）。

1.3 實驗步驟

1.3.1 曠場實驗

將小鼠放到曠場箱中，讓其自由探索15 min，觀察其自主運動能力，記錄其總共移動的距離、速度和持續時間。另外，將其在邊緣區域移動時間的百分比作為衡量小鼠焦慮樣行為的一個指標。

1.3.2 新異物體識別實驗

實驗開始前，將小鼠放到曠場箱中適應3 天。之后進行測試，在訓練階段，在曠場箱中放置2 個顏色、形狀一樣的物體，讓小鼠自由探索15 min。訓練1 h后，將其中1個物體換成顏色和形狀不同的物體，讓小鼠自由探索15 min；訓練24 h后，重復訓練1 h的操作，記錄小鼠探索2 個物體的時間。計算探索任一物體（訓練階段）或新物體（測試階段）的時間占探索2個物體總時間的百分比作為偏好指數（Preference index）來作為衡量學習記憶的指標。

1.3.3 Y迷宮實驗

Y 迷宮包括3 個臂，臂與臂之間的角度為120°。在訓練階段，用擋板堵住其中的1個臂，讓小鼠自由探索另外 2 個臂 8 min，1 h 后，撤掉擋板，開放第 3 個臂（稱為新臂），讓小鼠自由探索3個臂，記錄其進入新臂的次數和持續時間，來評估小鼠的空間記憶。

1.3.4 Western Blot 檢測突觸蛋白的表達水平

取（25-40）mg 小鼠前額皮質加入到預冷的200 μL 裂解液中，在研磨儀中研磨1 min，之后4℃離心（12000 rpm，10 min），得到蛋白原液。用借助BCA蛋白定量法對蛋白原液進行蛋白定量后，將蛋白濃度定到40 μg·10 μL-1這一標準，之后對蛋白進行變性，得到上樣樣品。經過電泳、轉膜的過程，得到轉印了蛋白的NC 膜，用5%的脫脂奶粉（目的蛋白：NR1；βactin）或 5% BSA（目的蛋白：p-αCaMKII）室溫封閉1 h，4℃孵 NR1 一抗（1∶1000）、p-αCaMKII 一抗（1∶1000）和β-actin 一抗（1∶1000），過夜，將膜放在搖床上用TBST 洗3 遍，每次10 min，搖床轉速（90-100）rpm，之后孵 HRP 標記的二抗（1∶3000），孵育 1 h，再用TBST洗3遍，每次10 min，搖床轉速（90-100）rpm。待涂勻發光液后，放入成像儀中成像。得到的圖片借助Image J軟件進行灰度值的測定。

1.3.5 qRT-PCR檢測IL-1β的mRNA水平

取（50-80）mg的小鼠前額皮質加入到1 mL Trizol中，之后研磨1 min，插入冰中，加入200 μL 氯仿，冰上靜置后離心，取400 μL上清，加入等體積的異丙醇，顛倒混勻后與冰上靜置，之后離心，倒掉上清，加入75%乙醇（DEPC 水配制）后離心，倒掉上清，倒扣晾干，加入20 μL DEPC 水溶解，用酶標儀測得濃度和純度，得到總RNA。借助逆轉錄試劑盒進行逆轉錄得到cDNA，再用PCR試劑盒配成10 μL體系，IL-1β引物序列為：Forward：CAGGCAGGCAGTATCACTCA；Reverse：AGCTCATATGGGTCCGACAT。在 PCR 儀中擴增，進而獲得Ct值，并計算2-△△Ct值作為基因的相對表達量。

1.3.6 ELISA檢測IL-1β的含量

取40 mg 小鼠前額皮質加入到200 μL 預冷的0.9% 的 氯 化 鈉 中 ，進 行 研 磨 1 min，4℃ 離 心（12000 rpm，10 min），獲得原液，借助BCA 蛋白定量法進行定量，確定上樣量。之后根據ELISA 試劑盒的說明書進行逐步操作，計算出IL-1β的濃度。

1.4 數據統計與分析

采用SPSS Statistics 21.0 軟件進行統計學分析，實驗數據采用X±S.E.M.表示，4 組間比較采用one-way ANOVA 分析，多重比較采用 LSD 檢驗，將P＜ 0.05 視為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 TCA對PS cDKO小鼠的運動能力沒有影響

在曠場實驗中，相較于WT 小鼠，PS cDKO 小鼠在曠場箱中移動的距離更長（P＜0.001），且速度更快（P＜ 0.001），表明PS cDKO 小鼠呈現高度活躍狀態，但TCA 治療后不影響PS cDKO 小鼠移動的距離和速度；此外，4組小鼠的邊緣區時間百分比沒有顯著差異（圖1）。以上結果表明TCA 對PS cDKO 小鼠的運動能力沒有影響。

2.2 TCA改善PS cDKO小鼠的短時辨識記憶障礙

圖1 TCA不影響小鼠的運動能力

圖2 TCA改善小鼠的短時辨識記憶

新異物體識別實驗中（圖2），在訓練階段，4 組小鼠的對于物體偏好性沒有明顯差異，在1 h 測試階段，與WT 組小鼠相比，PS cDKO 小鼠探索新物體的時間明顯減少（P＜ 0.01），這表明PS cDKO 小鼠短時辨識記憶受損，而TCA 治療后，PS cDKO 小鼠探索新物體的時間明顯增加（P＜0.05），這表明TCA 可以改善PS cDKO 小鼠受損的短時辨識記憶。然而，在24 h 測試階段，WT組小鼠探索新物體的時間明顯長于cDKO 組的小鼠（P＜ 0.05），這表明PS cDKO 小鼠長時記憶能力也受損，但TCA 干預后對其沒有顯著影響。另外，進行組內比較發現，cDKO+TCA 組的小鼠在1 h 測試階段對于新物體的偏好性明顯高于訓練階段（P＜0.05）。上述結果表明，TCA 改善PS cDKO 小鼠受損的短時辨識記憶，但對其受損的長時記憶沒有顯著性影響。

2.3 TCA改善PS cDKO小鼠的空間記憶障礙

在Y迷宮實驗中（圖3），在1 h測試階段，與WT組小鼠相比，PS cDKO 小鼠進入新臂的時間和次數明顯減少（P＜ 0.001），提示PS cDKO 小鼠表現出空間記憶障礙，而TCA 治療后，PS cDKO 小鼠進入新臂的時間和次數明顯增加（P＜0.001），這表明TCA 可以改善PS cDKO小鼠的空間記憶障礙。

2.4 TCA 上調PS cDKO 小鼠前額皮質中突觸蛋白（NR1、p-αCaMKII）的表達

NMDAR 在突觸功能、可塑性和神經元存活中發揮重要作用，其中，NR1 是NMDAR 的一個亞基，αCaMKII 是 NMDAR 的下游分子[19]。與 WT 組小鼠相比，PS cDKO 小鼠前額皮質中 NR1 和 p-αCaMKII 蛋白的表達明顯減少（P＜ 0.001，P＜ 0.05）；經過TCA 的介入治療后明顯上調這2 種突觸蛋白的表達（P＜0.05，P＜0.01），這表明TCA 可能發揮改善突觸功能障礙的作用（圖4）。

2.5 TCA 抑 制 PS cDKO 小 鼠 前 額 皮 質 中 IL-1β 的產生

與WT 組小鼠相比，PS cDKO 小鼠前額皮質中的IL-1β的 mRNA 水平明顯升高（P＜ 0.001），TCA 介入后，可以明顯下調IL-1β的mRNA 水平（P＜ 0.001）（圖5）。ELISA 檢測也得到了一致的結論，與WT 組小鼠相比，PS cDKO 小鼠前額皮質中的IL-1β的含量明顯增多（P＜ 0.01），TCA 治療后，可以明顯降低IL-1β的含量（P＜0.05）。無論是從mRNA水平還是蛋白水平，TCA 都可以抑制 PS cDKO 小鼠中增高的 IL-1β，從而減少IL-1β的產生。

圖3 TCA改善小鼠的空間記憶障礙

圖4 TCA上調PS cDKO小鼠前額皮質NR1和p-αCaMKII蛋白的表達

圖5 TCA抑制PS cDKO小鼠前額皮質IL-1β的產生

3 討論

AD 病理過程錯綜復雜，提出的機制假說也很多，但是目前尚未出現令人滿意的治療藥物。近些年來，神經炎癥在AD 病理過程中發揮的作用越來越受到重視，一些流行病學的研究也建議使用抗炎藥物減少AD 的發病率[5]。慢性炎癥會促進突觸和神經元的丟失、影響突觸可塑性、促進tau 蛋白的磷酸化和損害認知功能[13]。并且在AD 患者的額葉皮質發現炎癥水平的上調，另外，tau蛋白的磷酸化與炎癥水平成正相關，與突觸密度呈負相關[20]。在慢性炎癥的過程中，激活的小膠質細胞產生和釋放促炎因子，如：IL-1β和腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）等，過度和大量釋放的促炎因子對腦功能造成損傷[5]。另外，在去世的AD 患者的腦中發現小膠質細胞激活和促炎介質水平的增高，并且AD 模型小鼠也支持慢性炎癥在AD病理機制中發揮重要作用[21]。

對于TCA 這一藥物，本實驗室之前發現其可以通過阻斷6 月齡的PS cDKO 小鼠的NF-κB 信號通路來抑制神經炎癥，從而改善NMDA 受體的功能障礙、突觸功能障礙和小鼠的記憶能力[17]。由于PS cDKO 的AD 樣表型是年齡依賴性的，那么，對于12 月齡的PS cDKO 小鼠，TCA 是否還具有治療效果，本次研究進行了初步探索，發現TCA 仍具有一定的神經保護作用。在行為學方面，和6月齡的PS cDKO 小鼠相似的是，12月齡PS cDKO 小鼠依然表現出短時辨識記憶和空間記憶受損。不同的是，在新異物體識別實驗24 h 的測試中，12 月齡的PS cDKO 小鼠表現出了探索新物體的時間顯著低于WT 組的小鼠，表明其具有長時記憶能力障礙，這與之前的研究報道結論是一致的[22]。經過為期3 個月的TCA 干預，可以改善PS cDKO 小鼠受損的短時辨識記憶和空間記憶，但長時記憶能力障礙沒有影響。

NMDAR 為谷氨酸門控離子通道型受體，對Ca2+和Ca2+內流具有很高的滲透性，這是突觸形成的必要條件[23]，其在學習記憶的過程中發揮重要作用[24]。NMDAR 亞基包括 NR1、NR2（A-D）和 NR3（A、B），并且其功能異常與AD 密切相關[25]。CaMKII 是一種突觸蛋白，在NMDAR 參與的Ca2+內流誘導的長時程增強中被激活[26]，其和NMDAR 是突觸可塑性（長時程增強和長時程抑制）的中心介質，而突觸可塑性是學習記憶的基礎[27]。在12 月齡的PS cDKO 小鼠的前額皮質中，NR1 和 p-αCaMKII 這 2 種蛋白的表達是明顯降低的，而TCA 能夠上調這2 種突觸蛋白的表達水平。但是我們以前的研究中TCA對于6月齡的PS cDKO小鼠前額皮質中的表達水平減少的NR1 蛋白沒有明顯的改善作用[17]。IL-1β是一種促炎癥因子，其過度產生會使神經元可塑性和記憶功能受損[28]，相較于WT 組的小鼠，12 月齡的 PS cDKO 小鼠前額皮質中 IL-1β的mRNA 水平和蛋白水平明顯升高，而TCA 的介入可以明顯抑制IL-1β的產生。

根據目前的結果，無論是6月齡還是12月齡的PS cDKO 小鼠，TCA 都能夠發揮抑制促炎癥因子IL-1β產生、上調NR1 和p-αCaMKII 突觸蛋白的表達和改善短時記憶和空間識別記憶障礙的作用。但是TCA 對于12 月齡PS cDKO 小鼠其它的突觸蛋白和促炎癥介質（如：TNF-α、IL-6、iNOS、COX-2）是否會有影響，以及通過哪條信號通路發揮作用仍需進一步地探索。

綜上所述，TCA 能夠抑制前額皮質促炎癥因子IL-1β的產生、上調突觸蛋白的表達和改善PS cDKO AD 樣小鼠的記憶障礙，具有一定的抗炎和神經保護作用，對于其內在機制尚需進一步的研究，為臨床研究提供可供參考的治療思路。