基于Rho/Rock通路的三七茜草有效組分宮腔給藥對IUD模型大鼠子宮血管平滑肌細胞表型轉化機制研究＊

丁 楠，師 偉，王雁飛，刁翰林，王 新，程文秀，陳思儒，徐 麗

（1. 山東中醫藥大學中醫學院 濟南 250014；2. 山東中醫藥大學附屬醫院 濟南 250014；3. 山東中醫藥大學第一臨床醫學院 濟南 250014；4. 山東大學附屬省立醫院 濟南 250021）

宮內節育器（Intrauterine device，IUD）是我國育齡婦女主要的避孕措施，使用比例高達49.79%[1]，具有安全、有效、經濟、可逆等優點。但育齡婦女放置IUD后，常引起子宮局部免疫因子、激素、子宮內膜血管活性物質和血管內皮生長因子異常，從而導致子宮異常出血[2]，且發病率為放環婦女的20% - 50%[3]，嚴重影響患者的生活質量與使用IUD避孕的接受度。

表1 引物名稱序列

課題組前期研究表明，IUD 出血副反應與子宮血管平滑肌細胞（Vascular smooth muscle cell，VSMC）表型轉化密切相關[2]，宮寧顆粒可有效治療IUD 出血副反應[4,5]，可使子宮VSMC 合成型轉化成收縮型[6,7]，而目前公認Rho/Rock 通路為VSMC 表型調控的重要環節。以此為基礎，考慮到長期服用中藥的患者依從性較低，為探索更簡便的給藥途徑，選取宮寧顆粒主要有效藥物三七和茜草，制成三七茜草緩釋系統藥棒置入宮腔，觀察含有三七茜草有效成分的IUD 對治療IUD出血副反應的療效，同時檢測三七茜草有效成分對血小板源性生長因子（Platelet-derived growth factor，PDGF）、Rho/ROCK 信號通路相關信號分子、子宮VSCM 中收縮表型標志基因SM22α的影響，以此探討三七茜草有效成分通過Rho/Rock 通路治療IUD 出血副反應的機制。

1 材料

1.1 實驗動物

SPF 級SD 雌性已生育大鼠40 只（購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，動物合格證號：NO.370092000009759），體質量（250 ± 20）g。

1.2 實驗試劑及器材

三七茜草緩釋系統藥棒（山東中醫藥大學附屬醫院制備）；宮寧顆粒（國藥準字Z20010155）；大鼠血小板源性生長因子（PDGFA）酶聯免疫吸附試劑盒（武漢基因美生物科技有限公司，批號JYM0640Ra）；RhoA mRNA引物，ROCKⅡ mRNA引物，SM22αmRNA，引物（武漢塞維爾生物科技有限公司）（表1）；總RNA 提取試劑盒（成都福際生物，批號RE-03011）；水合氯醛；大鼠宮內節育器及宮內放器[8]；大鼠固定式陰道窺器；離心機；酶標分析儀；外科手術器械（眼科剪、眼科直鑷及彎鑷、鼻腔異物鉗）、1 mL 醫用注射器、碘伏、青霉素鈉、自制大鼠無菌單等（均由山東中醫藥大學附屬醫院提供）。

2 方法

2.1 IUD制作

2.1.1 SQ-IUD制作

按照課題組前期研究，提取宮寧顆粒功效的主要有效藥物——三七和茜草中的三七總皂苷和茜草總醌，使用相同方法制作SQ-IUD[8]。制作完畢后，使用環氧乙烷消毒。

2.1.2 普通IUD制作

制作無藥材加入的空白緩釋藥棒，其余操作與SQ-IUD 相同，使普通IUD 與SQ-IUD 規格相同。制作完畢后，使用環氧乙烷消毒。

2.2 動物分組

常規飼養1 周后，按照隨機數字表法將大鼠分為空白對照組（空白組）、IUD組、三七茜草有效組分宮腔給藥組（SQ-IUD 組）、宮寧顆粒灌胃組（宮寧顆粒組），每組各10 只，稱重，每組間大鼠的平均體質量差控制在20 g 以內，同時對每只實驗大鼠分別標記相應的實驗編號。

2.3 造模方法

空白組自然飼養，其余各組大鼠用10%水合氯醛麻醉固定后，采用無創式大鼠IUD 放置方法[9]，將SQIUD 放入SQ-IUD 組大鼠的一側宮腔內，IUD 放入IUD組及宮寧顆粒組大鼠的一側宮腔內。各組造模后連續3 天注射2 萬單位的青霉素，同時造模第2 天，宮寧顆粒組給予灌胃給藥，用生理鹽水按照28 g·100 mL-1配置，每日1次2 mL，連續14天。觀察造模后，大鼠飲食、精神、活動度、陰道分泌物情況。

2.4 標本采集及保存

造模14 天后，采集IUD 放置一側的大鼠子宮組織。使用10%水合氯醛腹腔注射，麻醉后固定大鼠，將大鼠腹中部皮膚去毛，常規消毒，鋪巾，開腹暴露子宮，觀察大鼠腹腔及子宮情況，剪取IUD 放置一側的子宮，用生理鹽水反復沖洗宮腔，并收集沖洗液，置于-80℃中保存；剪取IUD接觸區的一部分子宮組織立即投入裂解液中，嚴格按照總RNA 提取試劑盒說明書提取總RNA 并將提取液及組織置于-80℃中保存；另一部分子宮組織立即放在10%中性緩沖甲醛固定液中固定，做石蠟包埋和切片。

圖1 空白組

圖2 IUD組

圖3 宮寧顆粒組

圖4 SQ-IUD組

圖5 空白組

圖6 IUD組

圖7 宮寧顆粒組

圖8 SQ-IUD組

2.5 檢測指標

常規HE 染色，觀察子宮內膜形態學改變；采用免疫組化法，檢測RhoA 蛋白表達水平；檢測大鼠采用ELISA 法，檢測大鼠 PDGF 的含量；采用 PCR 法，檢測RhoA mRNA、ROCK Ⅱ mRNA 及 SM22αmRNA 的含量。

2.6 統計學方法

采用SPSS23.0 統計軟件，計量資料采用t檢驗，以均數±標準差（）形式表示，多組間比較符合正態分布的采用方差分析，不符合正態分布的采用秩和檢驗，以P＜0.05表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 大鼠造模后狀態

空白組大鼠一般狀態良好，子宮無明顯水腫；IUD組一般狀態良好，子宮炎癥水腫、充血情況嚴重；宮寧顆粒組與SQ-IUD 組一般狀態與空白組無差別，宮寧顆粒組子宮水腫、充血情況較空白組嚴重，較IUD 組減輕。SQ-IUD 組子宮無明顯水腫，輕微充血（圖1-圖4）。

3.2 子宮內膜形態學改變

空白組上皮細胞由大量纖毛上皮和少量分泌細胞構成，胞漿內可見核下空泡。腺體由大量分泌細胞及少量纖毛細胞構成，胞漿呈空泡狀，管腔擴張，可見少量嗜酸性分泌物。間質細胞無中性粒細胞浸潤。血管豐富，輕度擴張。內含少量紅細胞，內皮輕度增生。IUD組上皮細胞部分脫落、粘連。腺體擴張，內充少量中性粒細胞。間質重度水腫，間質內可見大量含鐵血黃素，大量嗜酸粒細胞及淋巴細胞散在浸潤。宮寧顆粒組表面上皮與空白組無明顯差異，部分腺體中度水腫，可見少量中性粒細胞，管腔擴張，可見少量嗜酸性分泌物，間質輕度水腫，少量淋巴細胞浸潤，無中性粒細胞，較IUD 組炎性細胞浸潤程度輕。SQ-IUD組表面上皮細胞、腺體與空白組比較無明顯異常，間質輕度水腫，少量淋巴細胞浸潤，較宮寧顆粒組炎性細胞浸潤程度輕（圖5-圖8）。

3.3 免疫組化結果

與空白組相比，各組大鼠子宮VSMC 中Rho/Rock通路相關蛋白RhoA 表達均明顯增加（P= 0.00）；與IUD 組相比，宮寧顆粒組與SQ-IUD 組的RhoA 表達明顯減少，差異有統計學意義（P=0.00）。同時，SQ-IUD組顯著低于宮寧顆粒組（P=0.00）（圖9-圖12、表2）。

圖9 空白組

圖10 IUD組

圖11 宮寧顆粒組

圖12 SQ-IUD組

表2 RhoA免疫組化結果

表3 PDGF結果（pg·mL-1）

表4 RhoA mRNA結果

表5 RockⅡ mRNA結果

3.4 ELISA法結果

與空白組相比，IUD 組、宮寧顆粒組PDGF 的含量顯著高于空白組（P=0.00；P=0.033），SQ-IUD組略高于空白組，但無統計學意義（P= 0.505）；與IUD 組相比，宮寧顆粒組與SQ-IUD 組PDGF 含量顯著降低（P= 0.00），SQ-IUD 組與宮寧顆粒組無差別（P=0.131）（表3）。

表6 SM22α mRNA結果

3.5 PCR法結果

3.5.1 RhoA mRNA

與空白組相比，IUD 組、宮寧顆粒組、SQ-IUD 組RhoA 的含量顯著高于空白組（P= 0.00）；與IUD 組相比，宮寧顆粒組與SQ-IUD 組RhoA 含量顯著降低（P=0.00）；同時SQ-IUD 組顯著低于宮寧顆粒組（P=0.00）（表4）。

3.5.2 ROCKⅡmRNA

RockⅡ mRNA 方面，與空白組比較，IUD 組的含量明顯增高（P=0.00），宮寧顆粒組與SQ-IUD 組含量升高，但結果無統計學意義（P=0.231；P=0.405）；與IUD 組比較，宮寧顆粒組與SQ-IUD 組均明顯降低（P=0.00）；與宮寧顆粒組比較，SQ-IUD 組降低，但結果無統計學意義（P=0.712）（表5）。

3.5.3 SM22αmRNA

與空白組相比，IUD 組與宮寧顆粒組中SM22α含量顯著減少（P= 0.00），SQ-IUD 組含量無明顯差異（P=0.166）；與IUD 組相比，宮寧顆粒組與SQ-IUD 組含量顯著增加（P= 0.02；P= 0.00）；與宮寧顆粒組相比，SQ-IUD組含量顯著增加（P=0.016）（表6）。

4 討論

子宮內膜周期性變化是一種生理性創傷修復過程，子宮內膜及其血管的發育不良和功能異常是導致子宮異常出血的主要原因[10,11]。課題組的前期研究證實[2,12,13]，IUD 出血副反應患者存在子宮內膜、血管功能異常，IUD模型大鼠存在子宮血管構筑形態學改變，并且與VSMC 表型轉化密切相關，表明VSCM 表型轉化可能是導致IUD出血副反應的關鍵性起始步驟。

VSMC 表型可分為收縮型和合成型，當血管受到損傷或在血小板源性生長因子（PDGF）和其他細胞因子刺激下，內側血管平滑肌細胞將遷移到內膜，加劇內膜的擴張，VSMC 由靜止-收縮狀態轉變為遷移-增殖-合成狀態，從收縮型轉化為合成型，這個過程稱為表型轉化[14,15]。特異性標記物的表達是描述VSMC 表型的最重要的特征之一[16]。SM22α是VSMC 的標志基因，且僅在收縮型VSMC 中表達[17]，與VSMC 的收縮功能有直接關系，而IUD 模型大鼠VSMC 表型以合成型為主[18]，由此可見 IUD 出血副反應與SM22α表達為負相關。Rho/Rock 信號通路可介導多種平滑肌功能異常的疾病，并被公認為VSMC 表型調控的重要環節。RhoA/ROCK 信號通路的激活會促進VSMC 的收縮，進行一系列磷酸化/脫磷酸化級聯反應，引起細胞骨架重組[19-20]。PDGF 被認為是血管早期發育的主要因素[21]和不可或缺的調節因子[22,23]。當內皮細胞受到損傷或者炎癥時，其表達水平明顯增高[24]，可側面反映出炎癥反應程度。同時，PDGF 可活化Rho，激活Rho/Rock 信號通路，引起細胞骨架重組[25]。而細胞骨架重組是細胞表型轉化的基礎，因此Rho/Rock 信號通路與VSMC表型轉化具有密切關系。曹飛鵬[26]等實驗表明，使用Rho/Rock信號通路抑制劑可減少大鼠頸動脈VSMC表型轉化，增加收縮表型VSMC 的標志蛋白SM22α的表達。顏建英[27]發現，Rho/Rock 通路與子宮平滑肌收縮性及產后出血密切相關。綜上所述，PDGF 等生長因子可刺激Rho/Rock 信號通路激活，從而引起VSMC 表型轉化，進而造成放置IUD后出血的發生。

多項研究表明，中藥通過調控Rho/Rock 信號通路治療平滑肌細胞功能異常的疾病具有良好療效[28]。中醫學認為“環臥胞宮，金刃損傷”是IUD 出血副反應的主要病因，其核心病機為“血瘀”[3]，并且易久瘀化熱。宮寧顆粒具有祛瘀清熱、止血調經的功效，從而使“瘀血得化，血能循經”。課題組前期研究證明，宮寧顆粒治療IUD 出血副反應具有良好療效[4,5]，并可使子宮內膜VSMC 合成型轉化成收縮型，抑制子宮內膜VSMC增殖，減少出血[6,7]，影響IUD出血的相關機制。宮寧顆粒的主要成分為三七和茜草，三七具有“止血不留瘀”的特點，茜草可以涼血止血、活血化瘀。現代藥理研究表明，三七、茜草提取物具有抗炎、止血、抗氧化等藥理作用，并且在免疫系統、心血管系統、神經系統等方面發揮重要作用[29,30]。吳震宇[31]等臨床觀察發現，三七能有效促進玻璃體切除術后再出血患者的積血吸收，說明三七止血效果顯著。薛露[32]等實驗表明，茜草可有效緩解子宮內膜增厚，達到止血效果。因此選用三七茜草制成三七茜草緩釋系統藥棒置入宮腔，以觀察對IUD副反應出血的療效。

在本實驗中，在三七茜草緩釋系統干預后，觀察到SQ-IUD 組較其他組子宮炎癥水腫充血情況明顯減輕（圖1～圖4），SQ-IUD 組PDGF 的含量較IUD 組顯著降低（P=0.00），但與宮寧顆粒組無差別（P=0.131），而PDGF 的含量可側面表現出炎癥反應程度，反映出三七茜草有效組分可明顯減少宮內節育器造成的局部炎癥反應，且與口服宮寧顆粒療效無明顯差別（表3）。據前文所述，PDGF 的降低會減少Rho/Rock 信號通路的激活。因此在Rho/Rock 信號通路方面，SQIUD 組的RhoA 蛋白含量顯著低于IUD 組與宮寧顆粒組（P= 0.00）（圖 9-圖 12、表 2），SQ-IUD 組 RhoA mRNA 的含量較IUD 組與宮寧顆粒組顯著降低（P=0.00），ROCKⅡmRNA的含量顯著低于IUD組，較宮寧顆粒組降低，但無統計學意義（P= 0.712），反映出宮內放置三七茜草緩釋系統可顯著下調Rho/Rock 通路，也與PDGF的降低減少了激活Rho/Rock信號通路有關（表4、表5）。在表型轉化方面，SQ-IUD 組的SM22αmRNA 含量顯著高于宮寧顆粒組與IUD 組（P=0.00），與空白組無明顯差別（P= 0.166）（表6），說明宮內放置三七茜草緩釋系統明顯增加了收縮表型VSMC標志基因的含量，有將VSMC 合成型逆轉化為收縮型的可能。綜上所述，在宮腔內放置三七茜草緩釋系統療效總體上優于口服宮寧顆粒，且避免了長期給藥繁瑣的不足，減少了炎癥反應的發生，可能通過抑制Rho/Rock 信號通路的激活干預子宮內膜VSMC 的表型轉化，從而減少VSMC 合成型的表達，減少放置IUD 后出血量，可能是預防IUD 出血副反應的作用機制之一。為今后放環婦女出現出血副反應的給藥途徑提供了新的思路，從而改善帶環婦女的生活質量，提高患者的依從性。但本課題后續還需要應用Rho/Rock 信號通路抑制劑進行體外細胞實驗加以驗證。