益腎健脾瀉濁中藥對慢性腎臟病妊娠大鼠腎臟NLRP3/caspase-1/IL-1β信號通路及細胞焦亡的影響＊

馮桃花，劉文康，武 寧，何 珍，徐賀鵬，周文平，梁文杰，2，許慶友，2，王 箏，2，王香婷，2＊＊

（1. 河北中醫學院 石家莊 050091；2. 河北省中西醫結合肝腎病證研究重點實驗室 石家莊 050091；3. 河北省中醫院 石家莊 050000）

慢性腎臟病（chronic kidney disease，CKD）流行病學研究表明，女性CKD 患病率急劇增加，CKD 影響約3%的孕婦[1]。2018 年世界腎臟日“關注腎臟病，關注女性健康”的主題提示女性腎臟健康已經成為全球關注的焦點。由于孕期腎臟血流動力學以及自身免疫功能的改變使得腎臟處于高灌注、高凝和高濾過狀態，導致原有的腎臟病復發或加重[2-4]。有研究顯示，妊娠前腎功能較差的婦女在妊娠期間血肌酐和腎小球濾過率異常更顯著，蛋白尿、高血壓都會增加腎衰的風險[5]。相比較CKD 1-2期的患者，CKD 3-5期患者早產率、剖宮產率、5 min 新生兒評分和新生兒重癥監護病房住院率顯著增加[6]，妊娠成為CKD 發生發展的重要因素。前期研究發現，妊娠誘導大鼠醛固酮分泌增多[7]，誘導的細胞增殖，促進腎間質纖維化進程[8]，同時觀察到腎小球大量巨噬細胞聚集。在此基礎上，本課題研究妊娠加重腎臟損傷的可能機制誘導巨噬細胞NLRP3 炎癥小體活化，炎性介質釋放，加重腎臟損傷。同時闡述以“脾腎虧虛，濁毒內蘊”為病機，以NF-κB/NLRP3/caspase-1/IL-1β為路徑，給予醛固酮受體阻斷劑及益腎健脾瀉濁中藥治療,探討益腎健脾瀉濁中藥對慢性妊娠腎病腎臟的保護作用以及對腎臟細胞焦亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及用藥

雌性Wistar大鼠購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，其中雌性未經產大鼠90 只，雄性大鼠20只，8周齡，體質量（160±20）g。依普利酮購于美國輝瑞制藥有限公司（生產批號024306），規格50 mg/片。益腎健脾瀉濁中藥藥物組成：黃芪20 g，當歸5 g，白芍12 g，山藥15 g，桑寄生12 g，山茱萸15 g，土茯苓20 g，澤瀉15 g，運用神威藥業免煎中藥配方顆粒(生產批號17103061，17102361，17091411，17062111，17052714，17081151，17061251，17032651），將藥物混勻煎煮15 min，配成混懸液。

1.2 主要試劑與儀器

NF-κB p65 抗 體（servicebio 公 司 ，生 產 批 號181905）；NLRP3 抗體（novus 公司，生產批號 IMG-6665A）；Caspase-1 抗體（proteintech 公司，生產批號00019089）；IL-1β抗 體（abcam 公 司 ，生 產 批 號309542-23）；GAPDH 抗體（bioworlde 公司，生產批號54162）；TUNEL 試 劑 盒（Eterlife 公 司 ，生 產 批 號11422200）；Cr 試劑盒貝克（曼庫爾特實驗系統有限公司，生產批號AUZ3562）；BUN 試劑盒（曼庫爾特實驗系統有限公司，生產批號AUZ3611）；TP 試劑盒（Thermo Fisher Scientific 公司，生產批號23227）；ALD試劑盒（天津九鼎醫學生物工程有限公司，生產批號RA21810）。小型垂直電泳槽、半干轉印槽為Bio-Rad公司產品；病理圖文分析系統DP7 2CCD，顯微照相儀、BX53 顯微鏡產于 Olympus 公司；γ-放射免疫計數器FJ-2021，西安二六二廠。

2 方法

2.1 模型建立及動物分組

在前期實驗中，慢性腎臟病動物模型主要參考Truong LD[9]等所寫文獻通過單側輸尿管結扎手術制備[10],并觀察UUO 術后 1、2、4、8、12 周大鼠腎臟病理變化及血肌酐、尿素氮變化。結果顯示：損傷至4 周，腎臟病理為炎性細胞浸潤較少，細胞增殖，腎功能無變化；損傷至8周，大量的炎性細胞浸潤，腎功能改變；12周大鼠血肌酐、尿素氮變化明顯。研究顯示，能否順利妊娠與腎損傷程度相關，CKD1-2期，Scr ＜ 1.4 mg?dL-1，血壓控制良好者，妊娠后GFR 變化不明顯；CKD3-5期，Scr ＞ 1.4 mg?dL-1患者，高血壓和先兆子癇風險顯著增高，甚者導致腎衰竭。實驗結果顯示，首先，UUO 術后56天Scr與CKD3-5期腎臟損傷Scr值相符；其次，根據大鼠2.5-3年壽命，折算人類壽命80歲，大鼠56天大約為人類4-5年，符合慢性腎病病程（參考秦川主編的《實驗動物學》）。綜上，我們選擇UUO 術后56 天復制慢性腎病模型，同時進行妊娠，復制CKD妊娠模型。

雌性Wistar 大鼠適應性喂養1 周，采用隨機數字表法將其分為6組：正常妊娠組（SP）、單側輸尿管結扎組（UUO）、UUO+ 妊娠組（UP）、UUO+ 妊娠 + 依普利酮組（EPL）、UUO+妊娠 +益腎健脾瀉濁方（TCM），每組各15 只；另取15 只作為對照組（Sham）。UUO 組采用單側輸尿管結扎手術復制慢性腎病模型，UUO 術后，EPL 組大鼠給予依普利酮100 mg?（kg?天）-1灌胃，TCM 組大鼠給予益腎健脾瀉濁中藥 3.11 g?（kg?天）-1（臨床上按成人換算劑量轉換系數6.25/114 g/天）灌胃。同時，Sham組給予相同體積的生理鹽水。慢性腎病模型制備后8周，妊娠組及治療組大鼠陰道涂片，動情前期、動情期進行合籠，記錄陰栓脫落為妊娠第1天，妊娠第19 天處死母鼠。實驗過程中，UUO 組因感染死亡 2 只，EPL 組死亡 1 只，UP 組死亡 1 只，因流產TCM組死亡1只，動物造模成功85只。

2.2 指標檢測及方法

對照組及其他分組大鼠妊娠第18天最后1次灌胃后禁食并將其放入代謝籠，收集24 h尿液，1500 r?min-1離心5 min 分裝，凍存至-20℃，用于檢測24 h 尿蛋白。次日10%水合氯醛0.04 mL?g-1體重腹腔注射麻醉后，股動脈取血，將血液收集到無菌管中，室溫靜置20 min，4℃和8000 r?min-1條件下離心10 min，取上層血清后-4℃存儲，用于檢測血清醛固酮、血肌酐、尿素氮。摘取雙側腎臟，對比拍照后，將健側腎臟浸入4%多聚甲醛 48 h，用于病理學 HE、Masson、TUNEL 及免疫組化染色，部分腎組織-70℃保存行蛋白檢測。

2.2.1 腎臟組織病理染色

石蠟包埋、切片，二甲苯脫蠟3 × 15 min，梯度濃度乙醇進行水化，進行蘇木精-曙紅染色、Masson 三色染色，觀察腎組織病理變化及評估纖維化水平。

2.2.2 各組大鼠醛固酮表達情況

檢測各組大鼠的血清醛固酮及腎腎組織醛固酮含量，按照檢測試劑盒說明書進行操作。

2.2.3 各組大鼠腎功能、24 h尿蛋白定量

按照血清檢測試劑盒說明書進行操作，采用全自動生化分析儀檢測血清肌酐（Scr）的水平，尿素酶-谷氨酸脫氫酶法測定尿素氮（BUN）水平，使用BCA 法進行24 h尿蛋白定量測量。

2.2.4 腎臟組織TUNEL染色

腎臟組織切片后經二甲苯脫蠟，酒精梯度水化，消除內源性過氧化物酶，檸檬酸緩沖液微波高火力1 min 進行破膜，孵育20%牛血清室溫30 min 封閉組織，加入反應液（Enzy∶Lable=1∶9），陽性對照組只加入Lable，37℃孵育 60 min，PBS 清洗，滴加過氧化物酶（POD）37℃孵育 60 min，PBS 浸洗；鏡下觀察 DAB 顯色，呈現淺黃色底色清水終止反應，蒸餾水沖洗5 min，蘇木精復染細胞核，脫水透明封片；光鏡下觀察細胞核呈棕黃色為陽性表達，隨機觀察鏡下（×400）不重復的20個視野，由焦亡細胞與總腎細胞的比率來計算腎細胞焦亡水平。

2.2.5 采用免疫組織化學法檢測腎組織NF-κB p65、NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白表達

切片，二甲苯10 min 脫蠟，梯度酒精脫水，加入3%過氧化氫15 min 以封閉內源性過氧化物酶，浸泡在枸櫞酸緩沖液中，微波爐高火力20 min 進行抗原修復，室溫冷卻，PBS清洗后用山羊血清10 min處理以減少非特異性結合。將切片與一抗NF-κB p65（1∶500）、NLRP3（1∶2 00）、Caspase-1（1∶200）、IL-1β（1∶100）在4℃過夜；用酶標記的山羊抗小鼠/兔IgG聚合物進行二抗孵育，37℃孵育 15 min，PBS 清洗，滴加 SABC 復合物，DAB 顯色，蘇木精復染細胞核；酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片；鏡下觀察細胞核出現棕黃色或棕褐色深染為陽性表達。

2.2.6 蛋白質免疫印跡法檢測腎組織NF-κB p65、NLRP3、Caspase-1、IL-1β的蛋白表達

稱量等量腎臟組織，采用4：1 比例加入裂解液裂解組織蛋白及蛋白酶抑制劑，在冰上剪碎組織，微波粉粹儀進行勻漿后靜止30 min，4℃，8000 r?min-1離心10 min，靜置15 min，提取上清并采用4∶1 比例加入蛋白緩沖液，煮蛋白5min 后進行分裝并置-80℃凍存。起始以20 ug 蛋白進行上樣，90-120 V 電泳，半干轉膜25 min，室溫5%脫脂牛奶封閉2 h，加入兔抗鼠一抗NF-κBp65（1∶500）、NLRP3（1∶1000）、Caspase-1（1∶500）、IL-1β（1∶1000），同時用 GAPDH（1∶20000）作為內參校正。4℃孵育過夜或室溫孵育2 h，TBST 清洗8 min*3 次，室溫孵育羊抗兔二抗（1∶20000）2 h，TBST清 洗 8 min*3 次 ，TBS 清 洗 1 次 。 使 用 Image studio Ver5.2系統進行定量分析。

2.3 統計學方法

采用SPSS 23.0軟件進行統計學分析，以均數±標準差()表示連續變量，符合正態性和方差齊性檢驗數據選擇單因素方差分析，采用單因素方差分析SNK 法比較6組間差異。不符合正態檢驗條件采用秩和檢驗，方差不齊采用Tamhane、Dunnett T3方法統計。P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 各組大鼠腎組織病理形態學改變

Sham 組腎小管形態正常，觀察到微量炎癥細胞。SP組病理炎癥細胞浸潤增加。UUO、UP組出現嚴重的腎小管擴張，上皮細胞脫落，細胞腫大，胞核染色質濃縮，染色質邊集或細胞核消失，腎間質大量的炎細胞浸潤，腎小管形態不完整。兩組相比較，UP 病理改變明顯。與UP組比較，EPL、TCM組病理損傷減輕（圖1）。

圖1 依普利酮及中藥治療CKD妊娠大鼠腎組織病理形態改變（×400）

Masson 三色染色顯示，與 Sham 組對比，UUO 組腎小管間質及細胞外基質纖維化明顯，UP 組進一步加重，通過EPL、TCM治療后腎纖維化明顯減少。

3.2 各組大鼠醛固酮含量測定

血清醛固酮及腎組織醛固酮含量評估鹽皮質激素受體活化情況，與Sham 組相比SP有所增加，但無統計學意義；UUO組醛固酮顯著增加（P＜0.05），UP組較UUO 組表達明顯（P＜0.05），兩給藥組醛固酮含量顯著下降（P＜0.05）。腎組織醛固酮檢測結果顯示，較Sham 組比較，SP 組表達增加，UP 組與 UUO 組比較顯著增加（P＜ 0.05），兩給藥組均顯著下調（P＜ 0.05），組間無明顯差異（表1、圖2）。

3.3 各組大鼠腎功能及24 h尿蛋白含量

運用血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）及24 h尿蛋白評估腎臟損傷，與Sham 組相比，BUN 及24 h 尿蛋白兩個指標SP 組水平顯著升高（P＜ 0.05），Scr 水平增加，但無明顯差異。UUO 組各腎功能指標明顯增加（P＜0.05），表明成功通過單側輸尿管結扎手術建立慢性腎病模型，與 UUO 組相比，UP 組 Scr、BUN 及 24 h 尿蛋白定量明顯升高（P＜ 0.05），EPL 組和TCM 組BUN、24 h尿蛋白定量顯著下降（P＜0.05），但組間無統計學意義。表明兩用藥組對慢性腎病妊娠導致的腎功能損傷有保護作用（表2、圖3）。

表1 依普利酮及中藥治療改善CKD妊娠大鼠醛固酮含量(,n = 8)

表1 依普利酮及中藥治療改善CKD妊娠大鼠醛固酮含量(,n = 8)

注：與Sham組比較，＃P ＜ 0.05；與SP組比較，▲P ＜ 0.05；與UUO組比較，▽P ＜ 0.05；與UP組相比，*P ＜ 0.05

腎組織醛固酮/（ng?mL-1）0.593±0.126 0.797±0.139 1.007±0.255#▲1.587 ± 0.300#▲▽0.913±0.216#*1.001±0.308#*Group Sham SP UUO UP EPL TCM血清醛固酮/（ng?dL-1）7.625±0.475 8.486±0.549 11.336±0.549#▲12.816 ± 0.785#▲▽10.943±0.621#*11.288±0.514#*

圖2 依普利酮及中藥治療改善CKD妊娠大鼠醛固酮含量

表2 依普利酮及中藥治療改善CKD妊娠大鼠腎功能(,n = 8)

表2 依普利酮及中藥治療改善CKD妊娠大鼠腎功能(,n = 8)

注：與Sham組比較，＃P ＜ 0.05；與SP組比較，▲P ＜ 0.05；與UUO組比較，▽P ＜ 0.05；與UP組相比，*P ＜ 0.05

24 h尿蛋白/（g?24 h-1）1.518±0.578 1.547±0.438#2.433±0.593#▲3.352 ± 0.625#▲▽2.352 ± 0.863#▲*2.435 ± 0.864#▲*Group Sham SP UUO UP EPL TCM尿素氮/（mmol?L-1）6.252±0.993 6.873±0.803#7.705± 0.896▲#8.557 ± 0.723#▲▽7.998±1.055#▲8.299±1.091#▲血肌酐/（μmol?L-1）56.958±5.067 61.716±6.712 65.261±5.489#73.849 ± 5.721#▽▲63.086±11.590*64.811±4.604#*

3.4 TUNEL 染色檢測各組大鼠腎臟組織細胞DNA 損傷情況

SP 組較 Sham 組 TUNEL 陽性細胞表達增多（P＜0.05）；與 SP 組比較，UP 組 TUNEL 染色的細胞陽性率明顯升高（P＜0.05），主要位于擴張的遠端小管；與UP組比較，EPL、TCM 組的細胞陽性率較UP 明顯下降（P＜ 0.05）（表3、圖4）。

3.5 各組大鼠腎臟NF-κB p65表達情況

Sham 組大鼠腎臟NF-κBp65 在遠端腎小管上皮細胞的細胞核中呈弱表達，與Sham 組比較，SP 組表達增加；與UUO 組比較，UP組表達增強（P＜ 0.05）；EPL、TCM 組與UP 組比較表達范圍及強度均明顯減弱（P＜0.05）（圖5-圖6）。

表3 TUNEL檢測依普利酮及中藥治療CKD妊娠大鼠腎臟細胞DNA損傷情況, n = 8

表3 TUNEL檢測依普利酮及中藥治療CKD妊娠大鼠腎臟細胞DNA損傷情況, n = 8

注：與Sham組比較，＃P ＜ 0.05；與SP組比較，▲P ＜ 0.05；與UUO組比較，▽P＜0.05；與UP組相比，*P ＜ 0.05

TUNEL陽性細胞率/%0.254±0.048 0.365±0.082 0.610 ± 0.075#▲*0.782 ± 0.024#▲▽0.578 ± 0.027#▲*0.605 ± 0.051#▲*Group Sham SP UUO UP EPL TCM

3.6 免疫組織化學法檢測各組大鼠腎臟NLRP3/Caspase-1/IL-1β信號通路分子表達情況

Sham 組大鼠腎臟 NLRP3、Caspase-1、IL-1β表達較弱；SP 組表達增強；UUO 組及UP 組表達明顯增強，UP 組表達陽性表達強于 UUO 組；與 UP 組比較，EPL、TCM 組表達均明顯減弱。NLRP3 主要表達于腎組織浸潤的巨噬細胞和腎小管上皮細胞；Caspase-1 和IL-1β表達于腎遠端小管上皮細胞胞漿（圖7）。

圖3 依普利酮及中藥治療改善CKD妊娠大鼠腎功能

圖4 TUNEL檢測依普利酮及中藥治療CKD妊娠大鼠腎組織DNA損傷情況（TUNEL，×400）

圖5 依普利酮及中藥治療CKD妊娠大鼠腎組織NF-κBp65在腎小管上皮細胞的表達（SABC，×400）

圖6 Western blot 檢測依普利酮及中藥治療CKD妊娠大鼠腎臟NF-κBp65表達

3.7 蛋白質免疫印跡法檢測各組大鼠腎臟NLRP3/Caspase-1/IL-1β信號通路蛋白表達情況

與Sham 組比較，SP 組各項指標表升高，其中NLRP3、Caspase-1、IL-1β明顯升高（P＜ 0.05）；與UUO組 比 較 ，UP 組 大 鼠 腎 臟 NLRP3、Pro-caspase-1、Caspase-1、Pro-IL-1β、IL-1β蛋 白 表 達 增 強（P＜0.05）；與 UP 組比較，EPL、TCM 組各項指標表達明顯下調（P＜ 0.05）（表4、圖8-圖10）。

4 討論

圖7 依普利酮及中藥治療CKD妊娠大鼠腎組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β在腎小管上皮細胞的表達

表4 Western blot 檢測依普利酮及中藥治療CKD妊娠大鼠腎組織NLRP3、Pro-Caspase-1、Caspase-1、Pro-IL-1β、IL-1β蛋白表達,n = 8

表4 Western blot 檢測依普利酮及中藥治療CKD妊娠大鼠腎組織NLRP3、Pro-Caspase-1、Caspase-1、Pro-IL-1β、IL-1β蛋白表達,n = 8

注：與Sham組比較，＃P ＜ 0.05；與SP組比較，▲P ＜ 0.05；與UUO組比較，▽P ＜ 0.05；與UP組相比，*P ＜ 0.05

IL-1β/GAPDH 0.036±0.002 0.043±0.004#0.053±0.003#▲0.065 ± 0.004#▲▽0.045± 0.007▽*0.033± 0.004▲▽*Group Sham SP UUO UP EPL TCM NLRP3/GAPDH 0.247±0.038 0.308±0.028 0.502±0.017#▲0.717 ± 0.041#▲▽0.390± 0.048▽*0.450 ± 0.049#▲▽*Pro-caspase-1/GAPDH 1.023±0.180 1.070±0.210 1.456±0.160#▲1.668 ± 0.130#▲▽1.184±0.150▽*0.975±0.130▽*Caspase-1/GAPDH 0.301±0.110 0.512±0.220 0.740±0.210#0.984 ± 0.060#▲▽0.563 ± 0.220#▽*0.049 ± 0.120#▽*Pro-IL-1β/GAPDH 0.283±0.021 0.415±0.043 0.605±0.029#▲0.779 ± 0.043#▲▽0.432±0.069#*0.532±0.036#*

圖8 Western blot檢測依普利酮及中藥治療CKD妊娠大鼠腎組織NLRP3蛋白表達

妊娠期心輸出血量增加，腎臟代償性體積增大30%，有效腎血漿流量平均增加70-80%，腎小球濾過率增加50%。在妊娠期，凝血因子Ⅰ-纖維蛋白原Ⅶ、Ⅷ、Ⅹ增加,出現高凝狀態。使腎臟處于高灌注、高濾過、高凝狀態[11]，可造成CKD 患者腎臟器質性損害，使原有腎臟病變加重。慢性腎臟病妊娠患者易發妊娠期高血壓疾病，其機制與RAAS 系統失衡有關。隨著RAAS 的深入研究，發現下游的醛固酮可能發揮重要的介導作用。CKD 妊娠期間，醛固酮水平升高使得血漿容量增加，對于維持循環血容量，血壓和子宮胎盤灌注至關重要[12]。腎臟損傷可激活RAAS，介導腎源性腎素分泌增多與胎盤產生雌激素作用于肝臟[13]，促進血管緊張素酶解，因而促進RAA S 主要效應分子AngⅡ的增加，發揮收縮血管，升高血壓的作用。且有研究顯示，醛固酮結合鹽皮質激素受體引起腎損傷[14]，給以醛固酮受體阻斷劑可以減輕糖尿病腎病[15]、慢性腎病、腎臟纖維化改變[16]。同時，醛固酮可介導炎性巨噬細胞聚集，上調炎性因子表達，激活NLRP3 炎癥小體，誘導細胞焦亡。

NLRP3 炎癥小體識別受損和垂死細胞釋放的內源性危險信號，在調節CKD 腎臟炎癥中發揮作用[17]。NF-κB 信號通路活化及損傷相關分子模式（PAMPs）可為NLRP3提供激活信號，NLRP3激活后發生自身寡聚化，募集ASC 及Pro-caspase-1 組裝成為炎癥小體，Pro-caspase-1 自身剪切成為成熟的Caspase-1，活化的 Caspase-1 切割 Pro-IL-1β和 Pro-IL-18，產生成熟的具有生物學活性的 IL-1β和 IL-18[18]。Toshiki 等據報道，醛固酮可誘導大鼠NLRP3炎性體表達增加并導致腎細胞焦亡[19]。細胞焦亡（Pyroptosis）是1 種新型促炎程序性細胞死亡，介于凋亡和壞死之間，其特征是DNA 損傷和膜穿孔[20]，由 Caspase-1 介導，焦亡細胞TUNEL 染色陽性，提示其DNA 發生斷裂損傷。NLRP3/ASC/Caspase-1/IL-1β/IL-18 軸活化誘導細胞焦亡，加重腎臟炎癥損傷。

圖9 Western blot檢測依普利酮及中藥治療妊娠大鼠腎組織Pro-caspase-1、Caspase-1蛋白表達

圖10 Western blot 檢測依普利酮及中藥治療CKD妊娠大鼠腎組織Pro-IL-1β、IL-1β蛋白表達

妊娠加重慢性腎病腎臟損傷，屬于中醫“子滿”“子眩”“虛勞”“胎氣”等。臨床主要癥狀為水氣，身重且以腰下腫甚，小便不利，水道不通，陽虛水濕不化，水濕內停，化生濁毒。根據慢性腎病發病特點，結合妊娠的特殊生理變化，素體脾腎虧虛，孕后血聚養胎，胎兒奪精傷母，氣血虧耗，唐·昝殷所著《經效產寶》亦認為，“臟氣本弱，因產重虛，土不克水。血散入四肢，遂致腹脹，手足面目皆浮腫，小便秘澀”。根據慢性腎臟病脾腎虧虛，濁毒內蘊的病機，結合妊娠特殊的生理變化，治療以治病與安胎并舉，確立益腎健脾瀉濁法，方藥由黃芪、當歸、白芍、山藥、山茱萸、桑寄生、土茯苓、澤瀉組成。方中以補五臟諸虛的黃芪，補益脾腎，為君藥。山茱萸補養肝腎，取“肝腎同源”之意；配伍山藥補益脾陰，亦能固腎，共為臣藥。孕后氣以載胎，血以養胎，方中黃芪與當歸以5∶1 的比例配伍，寓“當歸補血湯”補益氣血之意，扶助正氣，有形之血生于無形之氣，使氣旺血生。白芍養血益陰，為血中之血藥配當歸，加強補血之力；配伍桑寄生補腎安胎。本虛得固，胎兒得養。黃芪益氣推動水液運行，兼可利水。配伍澤瀉，以其甘淡，直達腎與膀胱，利水滲濕而泄腎濁。佐入土茯苓，味甘、淡，性平，入絡以滲利下導為務，以去濕濁。諸藥配伍，標本兼顧。全方共奏益氣健脾、養血瀉濁之功，采用此方加減治療慢性腎炎、腎病綜合征緩解期妊娠病人，尿蛋白未見增多，亦未出現妊娠中毒癥狀。本方的配伍特點：一是脾腎同治，重點在后天，使脾旺則氣血生化有源，氣行則濕化。二是氣血并補，但重在補氣，意在氣為血之帥，氣旺則血自生，血足則胎兒有所養。三是補益與祛濕并行，佐以澤瀉、土茯苓甘淡利濕，表邪得去。

現代研究顯示，黃芪具有抗炎、抗氧化應激損傷、免疫調節等作用，黃芪甲苷有效降低妊娠期高血壓，緩解血管內皮損傷引起的氧化應激和炎癥因子水平，改善腎組織細胞損傷[21]。黃芪可有效改善創傷應激大鼠腸黏膜免疫功能及NLRP3 炎癥小體的致炎作用[22]。Deng YP 等發現白芍總苷可下調NLRP3、caspase-1、IL-1β、ASC 蛋白表達，抑制細胞焦亡通路[23]。土茯苓具有清熱解毒、除濕、通利關節等作用，臨床廣泛應用于治療慢性腎衰竭，現代研究表明其具有抗抗炎、免疫調節、抗氧化等豐富的藥理學活性[24]。臨床上采用此法加減治療慢性腎炎、腎病綜合征妊娠病人，獲得較為滿意的臨床效果。

在本研究中，單側輸尿管梗阻妊娠大鼠增加醛固酮分泌，結合鹽皮質激素受體，進一步使NF-κB 信號通路活化，實驗結果顯示NF-κB P65 主要在腎遠端小管，蛋白表達同步增加，促進Pro-IL-1β等炎性因子的分泌；同時NLRP3/caspase-1/IL-1β信號通路蛋白表達增加，提示NLRP3 炎癥小體及Caspase-1 前體及成熟的蛋白活化，促進Pro-IL-1β切割成為具有致病力的IL-1β炎癥因子的產生。結果說明，單側輸尿管梗阻妊娠大鼠腎臟中存在焦亡，并且提示炎癥小體家族中NLRP3 炎癥小體是焦亡的重要標志，NLRP3 炎癥小體蛋白的增加促進IL-1β炎癥因子表達；同時，TUNEL染色觀察DNA 損傷情況進一步佐證這一結論，單側輸尿管梗阻大鼠DNA 斷裂百分比上升，UP 組較UUO 組陽性細胞數量增加13%，說明腎臟梗阻可以誘導腎臟細胞焦亡，妊娠是加重慢性腎病的獨立因素。MR 阻斷劑依普利酮及益腎健脾瀉濁方藥有效改善NF-κB 及NLRP3／caspase-1／IL-1β信號通路蛋白表達，提示可以通過鹽皮質激素受體阻斷劑（EPL）抑制鹽皮質激素受體及以上蛋白的表達，減少其下游炎性介質的釋放。進一步說明，慢性腎病患者妊娠刺激Ald 分泌增多，通過MR 活化-巨噬細胞浸潤-NF-κB/NLRP3-細胞焦亡為途徑介導炎性損傷。

據此，慢性腎病妊娠上調醛固酮含量，通過NF-κB 信號通路及 NLRP3/Caspase-1/IL-1β軸,誘導細胞焦亡，調控腎臟炎癥損傷。醛固酮阻斷劑依普利酮可以有效的通過抑制Ald-MR/NF-κB/NLRP3-Caspase-1-IL-1β通路。益腎健脾瀉濁中藥可抑制NF-κB通路和NLRP3 炎癥小體活化，減少誘導細胞焦亡，減輕炎癥損傷，從而發揮腎臟保護作用。