清肝益腎祛風方干預血管緊張素II誘導的小鼠高血壓及神經炎癥的作用研究＊

甄曉敏 ，王培偉 ，2，崔金剛 ，2，張 騰 ，2＊＊，陳 瑜 ，2＊＊

（1. 上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院 上海 200437；2. 上海市中醫藥研究院中西醫結合臨床研究所 上海 200437）

目前我國高血壓患病人數達2.45 億，僅45.8%的人接受了治療，得到有效控制的僅占16.8%[1]。臨床上雖然有多種類型降壓藥物可供選擇，包括鈣離子拮抗劑、血管轉換酶抑制劑、利尿劑、β受體阻滯劑等，但仍有大量難以有效控制的高血壓患者存在[2]，基于高血壓病理形成相關機制的新的防治藥物的研究具有重要的臨床意義。近年來研究發現神經炎癥參與了高血壓的病理過程，尤其是PVN（下丘腦室旁核）區小膠質細胞炎性激活可引起交感神經興奮性輸出增加，導致高血壓形成和發展[3-6]。PVN 區主導自主神經腦區，整合來自腦干和室周器的信號，通過延髓頭端腹外側及脊柱中外側柱將交感神經信號向周圍傳出，作用于心臟、血管、腎臟等效應器，引起血壓改變[7,8]。中藥復方多靶點、多途徑的效應模式在高血壓防治中發揮了積極的作用，進一步闡釋其血壓調節效應的相關機制有助于科學合理的臨床應用和推廣。

當代諸多中醫醫家認為高血壓病屬于眩暈、頭痛范疇，病變臟腑以肝腎為主[9]。課題組張騰教授認為除“肝亢”“腎虛”的基本病機外，“風盛”為同等重要的病機元素。參閱《蘭室秘藏》中“清空膏”與近代“三草一精湯”等組方精髓，并結合多年從事心血管疾病研究的體會及現代醫學研究成果，提出清肝益腎祛風法治療高血壓，擬清肝益腎祛風方（以后簡稱QYQ），臨證時辨證應用常獲良效[10]。課題組前期研究表明QYQ可顯著持久地降低自發性高血壓大鼠（Spontaneous hypertensive rat，SHR）血壓，并顯著降低系統性炎癥（TNF-α、Hs-CRP）及氧化應激（ROS）反應[11]，但QYQ能否抑制神經炎癥尚不清楚。

本研究以血管緊張素II（Ang II）誘導的高血壓小鼠為研究對象，并從QYQ對PVN區神經炎癥的干預作用進行探索，進一步為QYQ 多靶點、多途徑抗高血壓效應的生物學機制提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

6 周齡雄性 SPF 級 C57BL/6J 小鼠，體重（約 19-21 g），動物合格證號：SCXK（滬）2012-0002，購自斯萊克動物有限公司（上海），飼養于上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院動物實驗中心（合格證：SYXK（滬）2013-0109）。在溫度18-22℃，相對濕度35-55%環境中給予光照（12 h）/暗室（12 h）交替。

1.1.2 藥物與試劑

清肝益腎祛風方藥物組成（60 kg 成人1 日劑量）：炒黃芩15 g，夏枯草 30 g，石決明 20 g，黃連 6 g，柴胡15 g，川芎15 g，羌活15 g，防風15 g，川牛膝15 g，黃精15 g，桑寄生15 g，均為購自中國江陰天江藥業有限公司的顆粒劑，依據體表面積用藥量換算出小鼠的用藥劑量，20 g 小鼠用藥劑量（g·kg-1）約為 60 kg 成人的 12倍[12]，使用生理鹽水作為溶媒，加熱至沸騰使顆粒劑完全溶解，每次配制7 天用量于4℃冰箱保存，每日1 次灌胃給藥。

Alzet 滲透泵，美國 ALZET?Osmotic Pumps 公司；Ang II，美國 Sigma-Aldrich 公司；Trizol 裂解液，美國Invitrogen 公司；兔抗小鼠 IBA-1，日本 WAKO 公司；綿羊抗兔二抗，英國Abcam 公司；三氯甲烷、異丙醇、曲拉通X-100，上海國藥集團化學試劑公司；無水乙醇，江蘇強盛功能化學試劑公司；逆轉錄試劑盒，日本Takara 公司；LightCycler?480 SYBR?Green I Master，美國Roche 公司；焦碳酸二乙酯（DEPC），上海生物工程有限公司。

1.1.3 儀器

電子天平（型號：FA1004B），上海精密科學儀器有限公司；動物無創血壓記錄儀（型號：BP-98A），北京軟隆生物技術有限公司；微量臺式離心機（型號：5418），德國Eppendorf公司；冰凍切片機（型號：CM3050S）、正置熒光顯微鏡（型號：DM6000B）、正置顯微鏡（型號：DM2000），德國Leica 公司；高速冷凍離心機（型號：Microfuge?20R），美國Beckman Coulter公司；梯度PCR擴增儀（型號：5331），德國Eppendorf公司；微量紫外分光光度計（型號：BioSpec-nano），日本Shimadzu 公司；實時熒光定量PCR 系統（型號：LightCycler?480II），瑞士Roche公司。

1.2 Ang II誘導的高血壓模型制備

按照Alzet滲透泵（型號：2004）說明書進行藥劑填充及手術操作，即根據小鼠體重及Alzet滲透泵的釋放速率計算每只小鼠對應的滲透微泵內Ang II 的填注量，填注Ang II（模型組，避光填注）或者等量生理鹽水（假手術對照組）；裝填完成后，將滲透泵置于生理鹽水中，經37℃溫箱孵育過夜以激活；將8 周齡的雄性C57BL/6J 小鼠用水合氯醛（10%，300 mg·kg-1）腹腔注射麻醉，于上背部備皮，消毒后皮下植入滲透微泵。使Ang II 或生理鹽水按照 490 ng·（kg·min）-1的速率在小鼠皮下釋放4周。

1.3 動物分組與給藥

6周齡C57BL/6J雄性小鼠，給予自由進食、進水適應性喂養2 周，于此期間的上午時段對所有小鼠適應性測量血壓2 次。將小鼠隨機分為3 組，每組9 只，即假手術對照組（Sham 組），模型組（Vehicle 組），清肝益腎祛風方組（QYQ 組）。Vehicle 組及QYQ 組皮下植入含 490 ng·（kg·min）-1Ang II 的滲透泵，QYQ 組自造模后第1 日起開始給予QYQ 灌胃，而Sham 組及Vehicle組則給予同體積的生理鹽水灌胃，連續28 天，第28 天20時開始禁食，于次日取材。

1.4 血壓測量

分別于造模前1 天，及造模后第7、14、28 天（± 2天）采用tail-cuff 法測量小鼠血壓。測量血壓前將小鼠在置于保溫筒內的束縛器（由鼠袋與鼠網組成）中適應15 min，保溫筒溫度設定為38℃（室溫20-25℃），待小鼠適應并安靜之后重復測量尾袖血壓，當測得的血壓穩定后，取相鄰的5-6個血壓記錄。

1.5 組織切片制備

小鼠處死后使用生理鹽水經心臟灌注，清除大腦中殘留血液。仔細解剖并取出大腦，將其置于冰面上，從矢狀面正中半切。留取左側大腦用于Real time-PCR，取材立即冷凍存于-80°C 冰箱備用。右側大腦用4%的多聚甲醛固定2 晚，固定后，用1×PBS 沖洗，放入30%蔗糖/PBS 溶液，在4°C 浸泡過夜，待組織沉底后使用 OCT 膠（Frozen section compound）包埋。包埋好的腦組織在冰凍切片機中切20 μm 厚切片（從Bregma-0.58 mm 至Bregma-1.22 mm 行連續冠狀切片），4°C保存備用。

1.6 組織免疫熒光

選取PVN 中部（約Bregma-0.94 mm 處，圖1）連續3張冰凍切片，進行IBA-1免疫熒光染色，觀察PVN 區的免疫熒光染色改變情況，步驟如下：①取出切片在室溫下放置 20 min 后，用 1 × PBST（1‰ 吐溫溶于 1 ×PBS 內）沖洗切片5 min × 3 次，脫去OCT 膠；②滴加蛋白酶K（以1∶500 比例溶于1 × PBST 內）孵育20 min以修復抗原，后用1 × PBST 沖洗切片5 min×3 次；③滴加封閉液（1% TritonX-100 + 10%綿羊血清溶于1 ×PBST內），放入濕盒內室溫孵育1 h；④棄封閉液，滴加一抗兔抗小鼠IBA-1（1∶200，溶于封閉液內），后放入濕盒，4℃過夜；⑤棄一抗后，用1×PBST沖洗5 min×3次；⑥滴加Cy3 標記的綿羊抗兔二抗（1∶600，溶于封閉液內），室溫下孵育2 h 后，用1 × PBST 沖洗5 min ×3 次（避光）；⑦滴加DAPI 后，甘油明膠封片，避光備用。

1.7 小膠質細胞定量分析

使用熒光顯微鏡在200 倍下放大，從IBA-1 標記的切片上獲取PVN 區圖像，使用Stereo Investigator 軟件（Micro Bright Field，Inc.，Williston，VT，USA）進行定量。使用ImageJ（1.48 v，http://imagej.nih.gov/ij）軟件分析小膠質細胞（IBA-1+）分數面積（Fractional area）、平均熒光強度（Mean fluorescence intensity，MFI）及單位面積的胞體個數。Fractional area 是指單位面積內免疫陽性染色面積與總面積的比值。MFI指單位面積內免疫陽性染色光密度總和與其陽性染色面積的比值。單位面積的胞體個數，通過調整閾值和分析顆粒功能來實現，將閾值調整為程序自動提供的水平后再下調40點，并應用150像素大小的過濾器，在此設定下對細胞體的數量進行計數。每只動物（Bregma-0.94 mm 左右）連續的3 張切片中的9 個視野（每視野面積200 ×200 μm2）被選取并用于統計分析[13-15]。

圖1 PVN區解剖位置示意圖

表1 引物序列

1.8 PVN區IL-6、TNFα mRNA的表達

取小鼠左側下丘腦（重量約為8 mg），使用Trizol裂解液提取樣品總RNA，使用PrimeScriptTMRT reagent kit 將 RAN 逆轉錄為 cDNA；使用 SYBG 法進行 Realtime PCR 反應，應用 2-△△CT法處理結果，引物序列見表1。

1.9 統計方法

應用GraphPad Prism（version 8.0）統計軟件進行數據統計與分析，計量資料使用均數± 標準誤（Mean ±S.E.M）表示，多組間比較采用One-way ANOVA 方差分析，進一步的兩兩比較采用Tukey's multiple comparisons test，結果取P＜0.05具有統計學意義。

2 結果

2.1 QYQ 干預顯著抑制Ang II 誘導的小鼠收縮壓（SBP）升高

實驗過程中Sham 組小鼠收縮壓水平波動于102-119 mmHg 之間。與 Sham 組比較，Vehicle 組收縮壓從造模后第2 周開始顯著升高（P＜0.05），直到實驗結束，最高可達 149 mmHg；與 Vehicle 組比較，QYQ 組顯著抑制Ang II誘導的血壓升高（P＜ 0.05）（圖2）。

2.2 QYQ 干預顯著抑制Ang II 誘導的小鼠PVN 區小膠質細胞激活

與 Sham 組比較，Vehicle 組 PVN 區 IBA1+染色面積及強度明顯增加。與Vehicle 組比較，QYQ 組PVN 區IBA1+染色面積及強度明顯減少；定量分析顯示，與Sham 組比較，Vehicle 組 PVN 區 IBA1+染色相對分數面積、相對熒光強度及相對小膠質細胞數量均顯著升高（P＜ 0.05）。與 Vehicle 組比較，QYQ 組 PVN 區 IBA1+染色相對分數面積、相對熒光強度及相對小膠質細胞數量均顯著降低（P＜ 0.05）（圖3）。

2.3 QYQ 干預顯著抑制Ang II 誘導的小鼠PVN 區促炎因子mRNA的表達

與Sham 組比較，Vehicle組 PVN 區促炎因子IL-6、TNFα的 mRNA 表達水平顯著增加（P＜ 0.05）；與Vehicle 組比較，QYQ 組 PVN 區促炎因子 IL-6、TNFαmRNA表達水平顯著降低（P＜0.05）。

3 討論

圖2 QYQ的降壓效果

小膠質細胞功能類似于外周的巨噬細胞，起源于卵黃囊中紅系髓樣前體細胞，與單核細胞由骨髓造血干細胞不斷更新不同，健康大腦中駐留的小膠質細胞在成年期通過不斷的自我更新而持續存在。它們是保護大腦免受病原體入侵和組織損傷的第一哨兵[16]。體內雙光子成像研究表明，小膠質細胞的突起精細而富有可塑性，能夠在不干擾神經元纖維細絲的情況下延伸和收縮，并以此來掃描監視大腦內部微環境。小膠質細胞因此而具備快速運動能力，成為中樞神經系統內移動最快的細胞結構，在4 h 內就能監測到整個腦實質[17,18]。小膠質細胞對各種刺激敏感，如損傷、毒素、病原體、錯誤折疊的蛋白質、受損的神經元[19]，以及各種炎癥因子、促氧化因子、促高血壓因子（Ang II、鹽、醛固酮）[5,20]等。不同區域小膠質細胞被激活后，則進一步引發生相應的病理性改變。

圖3 PVN區IBA-1免疫熒光染色情況

研究發現Ang II 誘導的高血壓動物模型中存在PVN 區小膠質細胞激活，使用白喉毒素靶向消耗PVN區小膠質細胞后，可顯著減輕神經炎癥，抑制中樞交感神經興奮性輸出，進而實現降壓的目的[15]。四環素家族的米諾環素及四環素衍生物CMT-3 經側腦室注射，能夠通過抑制PVN 區小膠質細胞的激活而顯著降低Ang II誘導的血壓升高[4,5]。上述研究提示神經炎癥在高血壓病理形成中扮演重要的角色，高血壓相關神經炎癥機制為藥物作用機制的研究提供了新的切入點。

高血壓臨床表現多見肝腎陰虛、肝陽上亢，陰虛陽亢之證，QYQ 是基于高血壓陰虛陽亢、風陽上擾之證的治療高血壓的有效方劑[10]，課題組前期研究表明QYQ 在自發性高血壓SHR 大鼠模型中具有顯著的降壓效應[11]。然而，SHR 大鼠高血壓的發生具有復雜的遺傳因素，本研究則采用了高血壓形成機制明確的Ang II 誘導的小鼠高血壓模型，進一步闡明QYQ 的降壓效應途徑及機制。研究結果首次提示QYQ 具有拮抗Ang II 誘導的高血壓形成的效應。同時，本研究進一步評價了QYQ 干預對高血壓相關PVN 區小膠質細胞激活及炎癥因子表達的影響。結果表明，QYQ 干預可顯著抑制Ang II 誘導的PVN 區小膠質細胞激活、降低PVN 區炎癥因子表達水平，提示其對高血壓相關神經炎癥的顯著干預效應。

圖4 PVN區促炎因子mRNA表達情況

綜上，QYQ 能夠顯著抑制Ang II 誘導的小鼠血壓升高，同時顯著抑制PVN 區小膠質細胞激活及該區促炎因子 IL-6、TNFαmRNA 的表達。QYQ 對神經炎癥的調節作用可能是其防治高血壓的潛在機制之一。研究結果不僅為QYQ 防治高血壓提供了新的實驗依據，同時為中醫藥復方防治高血壓的研究提供了新的思路。