釀造技術對野生獼猴桃果酒有機酸組成及其品質的影響

劉淑珍，蘇穎玥，陳紅梅，常 遠，袁春龍，2

（1.西北農林科技大學葡萄酒學院，陜西楊凌 712100；2.陜西省葡萄與葡萄酒工程技術研究中心，陜西楊凌 712100）

野生獼猴桃在我國分布面積廣泛，秦嶺是主要的分布區之一，果實含有豐富的vitaminC（VC）、vitamin E、酚類等多種具有抗氧化作用物質，還含有多種生物活性物質，包括膳食纖維、氨基酸、礦物質及類胡蘿卜素等[1]，有利于人體健康[2]，備受消費者喜愛[3]。但就目前來講，野生獼猴桃果實小，采摘困難，推向市場的保存運輸費用高[4]，導致其價值不能充分得到發揮?；谝陨蠁栴}，釀造有特色的獼猴桃酒，有利于提高其利用率，助力山區居民的脫貧致富。目前，野生獼猴桃酒釀造仍存在一些問題，首先是果實成熟度不一致，難以控制，獼猴桃硬度會直接影響其酒的感官質量，包括香氣強度、糖酸含量。成熟度低的獼猴桃堅硬，且糖酸比低[6]。研究表明，延遲采收或后熟軟化都可以提高獼猴桃質量[7-8]。其次是果實中果膠含量高[9]，在榨汁過程中會導致獼猴桃酒出汁率較低，孫強等[10]、Towantakavanit[11]的研究表明，添加果膠酶可以有效提高出汁率，但溫度的上升會加速VC 分解[12]，需要探究果膠酶合適的用量、時間和溫度。再次是野生獼猴桃糖低酸高，康孟利[14]提出有機酸含量是影響獼猴桃酒質量的重要因素，雖然有機酸可以支撐酒體，使口感清爽醇厚，并起到抑菌的作用[13]，但若酸過高會使酒體失去平衡，產生不良口感。有研究發現利用D314 樹脂對果酒中的有機酸和總酸的降低均有很好效果[15-16]。本研究旨在針對野生獼猴桃酒加工中存在的關鍵問題開展研究，以改善野生獼猴桃酒的品質，提高野生獼猴桃的利用率，促進當地經濟的發展。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

材料：野生獼猴桃，采于陜西漢中佛坪。經測定，野生獼猴桃平均果重約為26.20 g/個；總還原糖含量為80.50 g/L；可滴定酸18.75 g/L；VC 含量約為1986.6 mg/kg；Brix 11%。

試劑：大孔樹脂（D314）、果膠酶，上海鼎唐國際貿易有限公司；濃硫酸（＞99.8 %）、超純水、草酸、酒石酸、蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸、奎寧酸、琥珀酸、乙酸，西隴化工股份有限公司。以上試劑均為分析純；商業酵母OFD，德國Erbsloh集團。

儀器設備：果實硬度計（GY-3），艾德堡儀器有限公司；高效液相色譜儀（LC-20A），日本島津公司；雷磁pH 計（PHS-3C），上海精密科學儀器有限公司；離心機（5424R），Eppedorf 公司；鼓風干燥箱（DGX-9243BC），上海南榮實驗室設備有限公司；低溫冰箱（DW-25W203），澳柯瑪股份有限公司；超聲波脫氣機（AS 3120B），天津奧特賽恩斯儀器有限公司；色譜柱（150×7.8 mm），美國菲羅門公司；抽濾機（AP-01P），天津奧特賽恩斯儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 工藝流程及操作要點

1.2.1.1 獼猴桃酒釀造工藝（參考李華[17]的方法）

野生獼猴桃→分選清洗→破碎壓榨→獼猴桃汁→接種酵母→啟動發酵→發酵監控→終止發酵→倒罐→澄清穩定→貯藏

1.2.1.2 操作要點

選擇成熟度較好且基本一致的獼猴桃進行清洗、壓榨，壓榨后過濾皮渣，用獼猴桃清汁發酵，添加60 mg/L 的SO2，酵母37 ℃活化20 min 后再添加，酵母菌接種量為200 mg/L，發酵溫度18～20 ℃，根據獼猴桃糖含量計算添加白砂糖，使發酵前糖含量為240 g/L，最終酒精度達到12 %（D314樹脂柱對酒度的影響忽略不計），監控發酵過程中的溫度、比重，以殘糖＜4 g為發酵完成。

1.2.2 研究內容

1.2.2.1 后熟過程監控

挑選成熟度較為一致的野生獼猴桃數組，每10顆一組，儲藏。每天隨機挑選一組，測定其中部和兩端的硬度，取獼猴桃壓榨汁，分別測定總還原糖含量、酸度、pH 值及可溶性固形物含量，并繪制在后熟過程中硬度與糖含量隨后熟時間的變化曲線。

1.2.2.2 野生獼猴桃汁酶解條件對果實出汁率的影響

以酶解溫度，果膠酶添加量和酶解時間為變量，以出汁率和VC 含量為因變量，進行單因素試驗，研究這3 種因素對獼猴桃出汁率的影響，根據單因素實驗的結果，找到這3 種因素較為合適的范圍，選擇果膠酶用量20 mg/L、40 mg/L、60 mg/L，酶解時間2 h、4 h、6 h，酶解溫度35 ℃、45 ℃、55 ℃進行正交試驗。

1.2.2.3 D314 樹脂對野生獼猴桃酒降酸效果的研究

以果汁直接發酵不降酸處理的野生獼猴桃酒為對照組，以果汁發酵前降酸及發酵完成后降酸處理為實驗組，實驗組采用D314 弱堿性樹脂降酸處理，方法均參照郝雅蘭[18]的方法，并略作調整：酒樣流速為17.5 mL/L；樹脂量10 mL 過濾柱：10×200 mm。

1.2.3 主要測定指標及方法

1.2.3.1 有機酸含量

①標準品的配制：分別配制濃度為5 g/L、5 g/L、5 g/L、2 g/L、0.5 g/L、1 g/L、10 g/L 的蘋果酸、檸檬酸、奎寧酸、酒石酸、草酸、琥珀酸、VC 標準樣品溶液，再按此濃度配制混合標準品溶液，并進行梯度稀釋，以峰面積（X）對質量濃度（Y）求回歸方程和相關系數，繪制各種有機酸的標準曲線。

②樣品預處理：將野生獼猴桃破碎制漿，10 min后取汁，5000 r/min 離心20 min 后取出，棄沉淀保留上清液。將制取的野生獼猴桃果汁及果酒經過0.22μm 微孔濾膜過濾，等待進樣。

③色譜條件：流動相A/B：0.025 μg/mL 硫酸溶液（0.36 μL 定容至1000 mL 容量瓶）；柱溫：25 ℃；流速：0.3 mL/min；檢測波長：210 nm；進樣量：20μL。

1.2.3.2 香氣成分

攪拌棒萃取-氣相色譜-質譜測定方法測定[20]。

1.2.3.3 基本指標的測定及方法

還原糖（葡萄糖計）、總酸（酒石酸計）、可溶性固形物、pH 值、游離SO2、揮發酸（醋酸計）、酒精度等常規指標的測定參照王華[19]的方法，所有指標均重復測定3次。

1.2.3.4 感官評價和分析

根據蘇鵬飛[21]葡萄酒感官評價方法進行獼猴桃酒的感官評價。

1.2.3.5 數據處理

采用SPSS 17.0 和Excel 2010 進行數據處理，結果表示為平均值±標準偏差；用Origin 9 進行作圖。

2 結果與分析

2.1 野生獼猴桃的后熟控制

低糖高酸是野生獼猴桃的重要特點[22]，在釀造過程中常通過調整糖分來提高酒精度，目前，國內外均以可溶性固形物含量作為果酒加工參照條件[23-24]，宋于洋等[25]認為，糖酸比可作為野生獼猴桃成熟度指標。在本實驗中以糖酸比作為后熟過程中的主要釀造技術指標。酸含量與總還原糖量之間的關系如圖1 所示。由圖1 可知，在室溫條件下，隨著野生獼猴桃儲藏時間延長，果實總還原糖含量呈緩慢增加的趨勢，且在13 d 時達到最大，之后緩慢下降，這與已報道的研究結果一致[26]；獼猴桃的酸含量緩慢下降，但是在儲藏后期基本保持不變的狀態。在13 d 時其果實糖酸比最大，但是由于13 d糖含量開始顯著下降，所以認為12 d 的糖酸比5.83為佳。

圖1 采后成熟過程中糖酸變化

從圖2可知，在儲藏過程中，野生獼猴桃總還原糖含量隨硬度的下降而上升，在一定時間后，總還原糖含量有下降的趨勢，這可能是因為前期果實中的淀粉分解使得糖含量升高，而后期果實新陳代謝消耗掉一部分糖所致，即當硬度在0.5～0.6 kg/cm2范圍內，糖含量達到最大，此時被認為是后熟過程中的最佳成熟點，也是獼猴桃成熟度控制主要釀造技術指標之一，這與糖酸比達到最大時的時間點相對應。在獼猴桃成熟過程中，其生理、組織會發生一系列的變化，硬度隨后熟過程急劇下降[27]。本實驗所使用的獼猴桃，后熟過程中硬度變化在0.39～1.15 kg/cm2之間。

圖2 采后成熟過程中果實硬度的變化

2.2 果膠酶對野生獼猴桃出汁率的影響

2.2.1 果膠酶單因素實驗

由圖3 可知，在25～65 ℃的酶解溫度范圍內，出汁率由52.63 %（25 ℃）增加到53.68 %（55 ℃），出汁率變化不大，但是，VC 含量變化明顯，由1900.32 mg/L降低到890.13 mg/L。隨著酶解溫度的升高，獼猴桃汁中的VC 含量明顯下降，且下降速度較快，符合高溫會加速VC 分解速率的情況。結合VC 的變化，35 ℃的酶解溫度合適，出汁率和VC 含量都處于較高水平，可以縮短加工時間。

圖3 酶解溫度對野生獼猴桃出汁率及VC含量的影響

由圖4 可知，在0～40 mg/L 的果膠酶添加范圍內，出汁率從32.7%增加到44.87%，出汁率顯著提高，當果膠酶添加量大于60 mg/L 后，出汁率增加的幅度降低，差異不顯著；而不同的果膠酶添加量對VC 含量影響較小，甚至沒有影響。綜合分析，認為果膠酶添加40 mg/L最合適。

圖4 果膠酶添加量對出汁率及VC含量的影響

圖5 酶解時間對野生獼猴桃出汁率及VC含量的影響

從圖5 可知，在溫度、果膠酶含量不變的條件下，酶解時間從0 h 增加到4 h，獼猴桃出汁率由31.9%增加到46.62%，在4～8 h 的時間范圍內，出汁率幾乎保持不變；整個酶解過程中VC 含量變化顯著，從1984.64 mg/L 降低至665.05 mg/L，4 h 時的出汁率達到最大值（46.62 %）。結合VC 含量的變化，4 h的酶解時間最合適。

2.2.2 出汁率的正交試驗設計及結果分析

根據單因素實驗的結果，選擇果膠酶（A）用量20 mg/L、40 mg/L、60 mg/L，酶解時間（B）選擇2 h、4 h、6 h，酶解溫度（C）選擇35 ℃、45 ℃、55 ℃進行正交試驗，結果見表1。

由表1 可得出，野生獼猴桃出汁率優化條件的最優組合是：A3B3C3，即果膠酶添加量為60 mg/L、溫度55 ℃、時間6 h；對該條件進行驗證實驗，得到出汁率為57.77 %，VC 含量為1674.8 mg/L。通過極差分析可知，影響出汁率的主次順序為：A＞C＞B，即果膠酶用量對出汁率的影響最大，其次是酶解溫度和酶解時間。

表1 果膠酶提高出汁率的正交試驗

2.3 野生獼猴桃酒降酸處理

2.3.1 有機酸的定性定量分析通過保留時間對6 種有機酸進行定性，利用不同濃度對應的有機酸峰面積計算出該物質回歸方程，參照回歸方程對樣品有機酸物質進行定量分析。有機酸的出峰順序為：草酸、檸檬酸、酒石酸、蘋果酸、奎寧酸、琥珀酸。

2.3.2 不同降酸方式對野生獼猴桃酒品質的影響

2.3.2.1 不同降酸方式對有機酸組成及含量的影響

圖6 不同降酸方式對有機酸影響

由圖6 可知，利用D314 樹脂降酸后，野生獼猴桃酒的可滴定酸含量顯著下降（p＜0.05），達到果酒標準，獼猴桃酒中的有機酸含量變化很大。

2.3.2.2 不同降酸方式對獼猴桃果酒香氣物質的影響

發酵開始前降酸和發酵完成后（殘糖＜4 g/L）降酸，比較不同降酸方式對香氣物質的影響。

由表2 可知，發酵后降酸處理的獼猴桃酒的香氣總含量（43949.26 μg/L）高于發酵前降酸處理（12968.31 μg/L），而低于對照組（62714.67 μg/L），三者之間存在顯著性差異（p＜0.05）。經實驗表明，大孔樹脂D314 降酸會影響獼猴桃酒中的香氣物質種類及含量，共檢出酯類19 種，發酵前降酸處理使丁二酸二乙酯、棕櫚酸乙酯含量分別降低85%、41%，但是發酵后處理則能使這兩種物質分別增加9%、22%。兩種處理使乙基己酸十八醇酯含量有少量下降，但該物質本身含量較低，不是主要香氣物質組成成分?？傮w來說，經過發酵前降酸處理的酯類物質減少較多，約為86%；而經過發酵后降酸處理的酯類物質有稍微的增加，基本保持不變，說明發酵后降酸處理比發酵前降酸處理能更好地保留酯類香氣物質。

不同酒樣中共有3 種醇類物質被檢出，發酵后降酸的酒樣中各醇類物質含量及總含量（3386.65 μg/L）與對照組含量相當（3324.67 μg/L），而顯著高于發酵前降酸處理酒樣中的醇類物質含量（463.80 μg/L）。發酵后降酸處理并不影響酒中

的醇類物質含量，而發酵前降酸處理酒樣中醇類物質含量顯著降低，這可能是因為樹脂在降低獼猴桃汁有機酸的同時，將生成醇類物質的前體物質帶走，嚴重影響了獼猴桃酒的整體香氣質量及口感。

表2 不同降酸方式對香氣物質的影響

3 種酒樣中共檢測出萜烯類物質7 種。對照組中的萜烯類物質含量最高（1473.79 μg/L），其次是發酵前降酸處理酒樣（337.17 μg/L），發酵后降酸處理酒樣中萜烯類物質含量最低（281.89 μg/L），降酸處理會顯著減少獼猴桃酒中的萜烯類物質含量，使獼猴桃酒的整體香氣有缺陷。

3種酒樣中共檢測出酸類物質16種，共同含有的物質有12種。發酵后降酸處理酒樣中的酸類物質總量（31925.68 μg/L）低于對照組（40096.64 μg/L），而顯著高于發酵前降酸處理酒樣中的酸類物質含量（7613.06 μg/L）。對照組酸類物質含量較為突出的有：辛酸、癸酸、十二碳酸、肉豆蔻酸、十五烷酸、棕櫚酸和7-十六碳烯酸。利用D314 過濾后，酒樣中的酸類物質顯著降低，特別是利用過濾后的果汁進行發酵的獼猴桃酒中，其酸類物質含量約為對照組酸類物質含量的1/6。酸類物質含量及組分對酒的感官評價有顯著影響，但并不是酸類物質含量越低，酒的酸度越低，可接受性能越強。

2.3.2.3 不同降酸方式對野生獼猴桃酒感官品質的影響

圖7 不同降酸方式對野生獼猴桃酒感官QDA的影響

從圖7 可知，發酵后降酸處理的酒樣澄清度、顏色、口感純正度、口感濃度及整體平衡方面均高于對照組和發酵前降酸處理酒樣；對照組獼猴桃酒在香氣純正度、香氣質量、香氣濃度方面均高于發酵前降酸處理酒樣，說明D314 弱堿性樹脂降酸會降低野生獼猴桃酒的香氣質量及濃郁度；發酵前降酸處理的酒樣感官可接受度較高，但其香氣、口感及整體平衡性較差，這可能是因為樹脂對果汁進行降酸處理帶走了香氣前體物質；綜合分析可知，降酸處理會影響野生獼猴桃酒的香氣感官質量及典型性，發酵前降酸處理不適合野生獼猴桃酒發酵，發酵后降酸處理可以有效保存野生獼猴桃酒的香氣特征，且通過降酸處理后整體平衡性提高。

圖8 不同降酸方式對野生獼猴桃酒香氣QDA的影響

從圖8 可知，對照組獼猴桃酒的果香、花香、獼猴桃品種香、草藥及生青味均高于降酸處理的酒樣；發酵后降酸處理后酒中的礦物質味、品種香、柑橘類香氣與對照組差別不大，說明發酵后降酸處理可保留獼猴桃特征香氣物質；發酵前降酸處理后酒樣的整體香氣質量相對較差，品種特征香味不突出。因此，利用D314 大孔樹脂對野生獼猴桃酒降酸時，應該采用發酵后降酸處理的方式，降低有機酸及可滴定酸含量的同時，可最大限度地保留野生獼猴桃的品種香氣。

3 結論

本實驗比較D314 弱堿性樹脂對獼猴桃酒的兩種降酸處理有機酸和品質的影響，對秦嶺野生獼猴桃酒加工技術有一定指導和參考意義。結果表明，該樹脂可使獼猴桃酒的總酸顯著下降（18.26～7.55 g/L），達到獼猴桃酒國家標準QB/T 2027—1994 的規定，有機酸組成有顯著差異（p＜0.05），與對照組和發酵前降酸處理相比，發酵后降酸處理獼猴桃酒香氣物質含量更高，能更好地保存獼猴桃酒的14 種特征香氣，香氣物質包括醇類、酯類、萜烯類、酸類及其他種類，其中果香、柑橘類香氣和獼猴桃品種香氣較為突出，在感官質量綜合分析中也有很好表現，且對果酒中其他理化性質影響較小，被認為是一種較好的降酸方式。為獼猴桃酒降酸提供新的參考方式，有助于提高獼猴桃酒整體品質，此工藝的最佳條件及適用性仍需進一步研究。