氣相色譜內標法測定白酒中乙酸乙酯含量的不確定度評定

左惠君，都 蕓，左惠蕓，邱怡筠，張露月

（1.煙臺市食品藥品檢驗檢測中心，山東煙臺 264000；2.江南大學生物工程學院，江蘇無錫 214122）

測量不確定度可以合理地表征被測量值的分散性[1]。通過測量不確定度可以了解到被測量值在什么范圍內，同時還可以定量說明一個實驗室的檢驗能力水平[2-3]。RB/T 214—2017《檢驗檢測機構資質認定能力評價檢驗檢測機構通用要求》[4]中明確規定檢驗檢測機構應根據需要建立評定測量不確定度的程序，在出現臨界值、內部質量控制或客戶要求時，應報告檢驗項目的測量不確定度[5]。由此可見，測量不確定度的評定對于檢驗檢測機構保證所出具數據的準確性和可靠性是十分重要的[6]。

酯類物質是形成白酒香氣的主要成分，可在不同程度上增加酒的香氣并決定香氣的品質。白酒中的酯類物質一部分是酵母菌、細菌、霉菌的胞內代謝產物，一部分來源于發酵后期酸和醇在釀酒微生物的作用下的酯化反應，是形成酒體不同香氣和不同濃郁程度的主要因素[7-9]。乙酸乙酯是構成清香型白酒主體復合香氣的主要物質。它的含量對判定清香型白酒的品質和質量等級有很重要的意義，也是實驗室中最常檢測的理化項目之一[10-12]。本文參照國家標準GB/T 10345—2007《白酒分析方法》[13]，采用氣相色譜內標法測定清香型白酒中乙酸乙酯含量。并按照JJF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》[14]對測量結果進行不確定度分析，通過數學模型的建立系統分析了各不確定度來源，并對各個分量進行評估和合成，為清香型白酒的質量控制和檢驗檢測結果評定提供一定的參考和指導。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器

樣品：市售白酒樣品。

儀器設備：Agilent 7890B 型氣相色譜儀配FID檢測器，美國安捷倫科技有限公司；AR224CN 型萬分之一精密分析天平，奧豪斯儀器（上海）有限公司；10～100 μL 可調量程移液器，Eppendorf 艾本德中國有限公司。100 mL、10 mL A 級容量瓶、1 mL A 級單標吸量管，天津市天科玻璃儀器制造有限公司。

1.2 標準溶液的配制

a.乙酸乙酯儲備液[2 %（v/v）]配制：用天平準確稱量2 mL 乙酸乙酯（色譜純）于100 mL 量瓶中（準確至0.000 1 g），用60%乙醇溶液定容至刻度，標準品濃度為c儲。

b.內標乙酸正戊酯溶液[2 %（v/v）]：吸取乙酸正戊酯（色譜純）2 mL，用60 %乙醇溶液定容至100 mL，濃度為c內0。

c.混合標準溶液：吸取乙酸乙酯儲備液1.00 mL移入100 mL 容量瓶中，加入內標溶液1.00 mL，用60%乙醇溶液稀釋至刻度。

1.3 測定步驟

氣相參數調至最佳，穩定后混合標準溶液進樣6 次，以乙酸乙酯與乙酸正戊酯（內標）峰面積比的平均值做校正因子f。

吸取樣品10.0 mL 于10 mL 容量瓶中，加入內標溶液100 μL，混勻后，在與f 值測定相同的條件下進樣，測定，做6 個平行。其中，第1 個平行樣品進樣6次，計算樣品峰面積比測量重復性，以前2次測定平均值為1 號樣品測得值，后5 個樣品只平行測定2 次，測定平均值為樣品測得值。檢測流程圖見圖1。

圖1 檢測流程圖

2 測量模型及測量不確定度分析

根據內標法原理，標準溶液校正因子：

樣品中乙酸乙酯的計算公式：

I為內標在樣品中的濃度：

式中：c標——混合標準溶液中乙酸乙酯的濃度，g/L；

c內——混合標準溶液中內標乙酸正戊酯的濃度，g/L；

A標——混合標準溶液中乙酸乙酯的峰面積；

A內——混合標準溶液中內標乙酸正戊酯的峰面積；

c儲——配制的乙酸乙酯儲備液的濃度，g/L；

c內0——配制的內標乙酸正戊酯溶液的濃度，g/L；

v標——配制混合標準溶液時乙酸乙酯吸取體積，mL；

v內——配制混合標準溶液時內標乙酸正戊酯吸取體積，mL；

v定——混合標準溶液的定容體積，mL；

A樣——酒樣中乙酸乙酯的峰面積；

A內-樣—酒樣中內標乙酸正戊酯的峰面積；

v樣——吸取酒樣的體積，mL；

v內-樣——酒樣中加入內標乙酸正戊酯溶液的體積，mL。

將公式（1）（2）（4）代入公式（3）得：

可得測量模型，X=F（c儲，v標，v內，v內-樣，v樣，

由此可知，樣品中乙酸乙酯測量結果不確定度主要來源于乙酸乙酯標準儲備溶液濃度、配制混合標準溶液時吸取乙酸乙酯標準儲備溶液體積及內標乙酸正戊酯溶液的體積、吸取樣品體積及加入內標溶液體積、校正因子測定時乙酸乙酯和內標峰面積比以及樣品中乙酸乙酯和內標峰面積比這7 部分。與內標乙酸正戊酯儲備液濃度、混合標準溶液定容體積及樣品加內標后體積之和都無關，這也是內標法的特點之一，這3 個因素可不予評定。根據測量模型，各不確定度分量分析因果圖見圖2。

3 不確定度評定

3.1 測量重復性

按照標準要求對一酒樣中的乙酸乙酯進行6次測定，測定結果見表1。

表1 酒樣中的乙酸乙酯測定結果

測量重復性不確定度：

3.2 乙酸乙酯標準儲備溶液引入的不確定度

乙酸乙酯標準儲備溶液不確定度主要是由標準品的純度、標準品的稱量質量、定容體積引入。

3.2.1 乙酸乙酯標準品純度P的不確定度

乙酸乙酯標準品證書表明，質量分數P=99.7%，U=0.2%，K=2。

純度P的相對不確定度為：

圖2 不確定度分量分析因果圖

3.2.2 乙酸乙酯標準品稱量質量m的不確定度

乙酸乙酯儲備液配制時，用萬分之一天平進行了兩次稱量，稱量得2 mL 乙酸乙酯標準溶液質量m 為1.8657 g。查天平檢定證書可知，天平的重復性標準偏差為0.2 mg，天平的重復性為極差，用極差系數C（6次）=2.53求標準偏差[14]。

稱量引起的相對不確定度為：

3.2.3 乙酸乙酯標準品定容體積引入的不確定度

乙酸乙酯標準品的定容使用的是A 級100 mL容量瓶，按照檢定規程其最大允差為±0.10 mL[15]，按照均勻分布，其不確定度為：=0.0577 mL。

定容過程中，溫度波動也會對定容體積造成影響。根據《新編酒精密度濃度和溫度常用數據表》[16]中表Ⅱ“酒精溶液密度與溫度和體積濃度關系表”，60%vol酒精在20 ℃左右的密度見表2。

表2 60%vol酒精在不同溫度下的密度

根據表2 計算得60%vol 酒精溶液體積膨脹系數:8.8×10-4/℃，明顯大于玻璃的膨脹系數。實驗室環境溫度變化為20 ℃±2 ℃，溫度波動按均勻分布k=，故溫度變化引起的不確定度為：

合成100 mL容量瓶引起的相對不確定度：

綜上，合成乙酸乙酯標準儲備溶液引入的相對不確定度為：

3.3 配制混合標準溶液時，吸取乙酸乙酯儲備液1.00 mL及加入內標溶液1.00 mL引入的不確定度

實驗室使用A 級1 mL 單標吸量管，最大允差為±0.007 mL[15]，按照均勻分布，其引入的相對不確定度為ur(V標)=ur(V內)==0.00404。

3.4 酒樣測定時取樣量和加入內標溶液引入的不確定度

酒樣取樣采用A 級10 mL 單標吸量管直接取樣，其最大允差為±0.020 mL[15]，因此按照均勻分布，酒樣取樣量引入的相對不確定度為：

向酒樣中加入100 μL 內標溶液是使用100 μL移液器，根據JJG 646—2006[17]可知，其量取100 μL時容量允許誤差為2%，可直接按均勻分布得出相對不確定度，加入內標溶液引入的相對不確定度為：

3.5 混合標準溶液中乙酸乙酯和內標峰面積比重復性引入的不確定度

氣相色譜儀器的重復性會對每次測量結果的準確性產生影響，因此校正因子測定時由此引入的不確定度應考慮在內[18-19]。本次測定使用的內標法，可以消除進樣體積、操作條件波動等很多因素的影響[20-21]，因此單純采用氣相色譜儀檢定報告中的重復性數據并不能真實表達這一不確定度分量。所以，在此次研究中，將峰面積比作為一個整體，通過平行測定實驗結果來計算不確定度。配制好加入內標溶液的混合標準溶液后，待色譜儀基線穩定，用自動進樣器進樣，平行測定6 次，記錄乙酸乙酯和內標峰的峰面積，用其比值計算出校正因子，結果見表3。

表3 校正因子測定時乙酸乙酯和內標峰面積比

表4 樣品中乙酸乙酯和內標峰面積比

3.6 樣品測定時乙酸乙酯和內標峰面積比重復性引入的不確定度

吸取樣品加入內標溶液混勻后，在與校正因子f 值測定相同的條件下用自動進樣器進樣，測定。第1 個樣品平行進樣6 次，計算其重復性，以前2 次測定平均值為1 號樣品測得值。結果見表4。

實驗過程中，一個樣品一般平行測定兩次，以前2 次平均值7.6466 計算，2 次測量重復性相對不確定度為0.00091。

3.7 合成標準不確定度

由評定過程可知，各不確定度輸入量之間相互獨立，因此，合成相對標準不確定度為：

合成標準不確定度為：

u(X)=ur(X)×X=0.0131×2.42=0.032 g/L。

3.8 擴展不確定度及不確定度報告

取包含因子k=2，擴展不確定度U=k×u(X)=2×0.032=0.064≈0.07 g/L

白酒中乙酸乙酯含量的結果：X=（2.42±0.07）g/L；k=2，各類相對不確定度主要分量及貢獻見圖3。

圖3 各不確定度分量值圖

4 結果與討論

采用氣相色譜內標法測定清香型白酒中乙酸乙酯含量，并對測量結果進行不確定度分析，得出該測定方法的擴展不確定度為0.064 g/L。通過內標法測量模型推算可知，樣品中乙酸乙酯的含量測定與內標儲備液濃度無關，與混合標準溶液定容體積無關，與樣品加內標后體積之和無關。

從圖3 可看出，由體積所引起的不確定度是影響乙酸乙酯含量測量不確定度的主要因素，其他不確定度分量大致相當。用100 μL 移液器向酒樣中加入內標溶液時引入的相對不確定度為0.0115，是最大的影響因素。近年來，移液器由于方便快捷而在實驗室普遍使用，這也提醒我們對移液器的規范使用和定期檢定維護是十分重要的。根據內標法的特點，以峰面積比為整體進行評定可以看出氣相色譜儀的重復性對測定結果的影響還是比較小的，這也是內標法定量相較于外標法定量的優勢之一。總之，在嚴格按照標準操作的基礎上，選用精度高的計量器具是降低不確定度很好的途徑。