時實熒光定性PCR 實驗室內質控方法的建立及探討

字立源，蘭曉燕，黃蘇金，楊婧涓，陳桂余，胡付娟，尹瀟，朱碧姝，李維錦，謝函凌，楊雪，朱榮華保山市中心血站檢驗科辦公室，云南保山 678000

目前， 實時熒光定量PCR 已廣泛應用于疾病臨床診療和醫學研究，如用于抗病毒藥物治療監測的外周血病毒含量測定，基因表達等方面。中國在2015 年底在無償獻血者中全面開展了核酸檢測，有效縮短窗口期，大大降低了輸血傳播病原體的風險[1]。核酸檢測室內質量控制對于保證NAT 結果的可靠性具有重要意義， 然而目前尚未能建立統一的NAT 質量控制方法。《血站核酸檢測實驗質量保證指南》中提到血站核酸測室內質控的基本要求：每一批檢測應至少有一個弱陽性室內質控品。該實驗室結合檢測系統的混樣方式及檢測下限，CT 值（實時監測擴增過程的熒光信號達到指數擴增時的循環周期數）與原始擴增模板數量呈負相關，可通過其與原始模板的函數關系，來計算原始模板的數量，評價該實驗室室內質控模式的可行性，監控室內質控體系的運行情況。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

試劑： 質控品標準物質采用北京康切斯特批號201706005， 試劑盒為蘇州華益美公司， 批號MA20171209，MA20180604 兩個試劑批號。 儀器：全自動核酸提取儀（HAMILTON STAR）；ABI 7500 熒光擴增儀（美國ABI 公司）。

1.2 標準品濃度的選擇

標準品濃度的選擇原則覆蓋高中低濃度值，室內質控濃度應盡可能接近試劑與系統最低檢測限，檢測用于檢測限濃度的質控品檢測的穩定性較差[2]。 根據最低檢測限，標準曲線制作選擇相應濃度值。

1.3 質控圖的繪制

連續測定20 次質控數值，計算其均值（X）和標準差（S），以X 為中心線，以質控值超過X±2S 為警告限， 超過X±3S 為失控限，作圖建立一個質控框架[3]。

1.4 實驗有效性判斷

試劑盒提供的陰性質控品對照陰性、陽性質控品對照陽性、內標的CT 有效值≤40；外部質控值超過（X±2S）為警告限， 超過（X±3S）為失控限。 同時，以Westgard 多規則質控方法進行輔助判斷，10 個質控值均落在均值一側，判定為失控。

1.5 統計方法

用Excel 表格繪制質控圖，統計學分析采用SPSS 17.0 統計學軟件。

2 結果

2.1 標準品濃度（IU/mL）與CT 值

理論濃度與檢測CT 值結果見表1。

表1 配制理論濃度與檢測CT 值

2.2 標準品濃度與CT 值在0.05 水平呈高度負相關

HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA 與CT 值的相關系數分別為（r=-0.873，-0.966，-0.797）。 CT 值與標準品濃度的函數關系依次為Y=-0.0236X+39.16，R2=0.762；Y=-0.0122X+41.452.16，R2=0.934；Y=-0.0016X+40.913，R2=0.635。

2.3 結果正態性檢驗

對2 個批次試劑119 次實驗質控CT 值以及通過相關函數計算濃度值進行正態性檢驗，試劑批號為MA20171209 的73 次實驗CT 值通過相關函數計算濃度值均服從正態分布（P＞0.05）；試劑批號為MA20180604 的46 次實驗CT 值及通過相關函數計算濃度值均服從正態分布（P＞0.05），見表2、3。

表2 質控品CT 值正態性檢驗

表3 質控品CT 值與對應函數關系計算濃度正態性檢驗

2.4 用“即刻法”進行室內質控情況

用HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA 的濃度值進行前20 次實驗的質量控制， 只有HBV-DNA 能完成20 次的控制過程均為在控狀態，HCV-RNA 和HIV-RNA 在未能到20 次，均有失控狀態發生。

2.5 Levey-Jennings 質控圖的建立

用CT 值與質控品濃度之間的函數關系分別計算HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA 的濃度值，計算結果經過正態性檢驗，服從正態分布，說明可以采用L-J 質控圖及相應的質控規則進行室內質控。 HBVDNA 前20 次采用即刻法，剔出離群值，計算前20 次均值（X），標準差（S），建立L-J 室內質控框架，從第21 次開始用L-J 質控。 HCV-RNA、HIV-RNA 采用預設固定框架法：即在更換試劑或質控品批號時，以上一批號濃度值均值（X）和標準差（S）建立框架。

3 討論

CT 值是當前實時熒光PCR 的主要定量參數。 它是實時PCR 的基本參數， 也是獲得準確且重現性好的數據的基礎。 起始模板量越多，熒光信號在統計學上顯著高于背景信號所需的PCR 循環數越少， 反之則越多。 基于PCR 原理的檢測方法可以用循環閾值（CT 值）作為檢測值做質控圖[4]。

但是直接利用CT 值原始數值作“即刻法或Levey-Jennings 圖”室內質控，很難滿足條件。 缺點有:①CT 值越小，起始濃度拷貝數越大；CT 值越大，起始濃度拷貝數越小；所以建立的質控圖不夠直觀,高值失控在L-J 質控圖上表現為低值失控， 實際結果剛好相反；②因采用的是PCR 定性實驗, CT 值的不精確度(CV)很小,容易造成假失控,在實際室內質控工作中很難實現，達不到監控核酸實驗有效性的目的。

在實時熒光PCR 中，每個模板的CT 值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關系， 起始拷貝數越多，CT 值越小。利用已知起始拷貝數的外部標準品可做出校正曲線。 因此，只要獲得未知標本的CT 值，即可從校正曲線上計算出該標本的起始拷貝數，這是采用外標進行實時熒光PCR 絕對定量的基本原理[5]。筆者實驗室證實，室內質控品濃度與CT 值在0.05 水平呈高度負相關，HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA 與CT 值的相關系數為（r=-0.873，-0.966，-0.797）。 根據相應檢測項目的回歸方程，計算出相應檢測項目外部質控品的濃度值。 這就是我們利用CT 值來定量起始拷貝數比用PCR 反應終點時所測得的PCR 產物量推斷的起始拷貝更可信的主要原因。趙航等[5]人用CT值與RNA 標準品拷貝數建立回歸曲線， 證明用此方法可以定量檢測相應病毒。

PCR 擴增產物呈指數增長， 擴增過程中， 影響PCR 反應的因素較多，稍有不同就可能會導致結果產生較大的變化。建立該實驗室可行的核酸標準化質量控制方法是實驗結果準確可靠的有力保障。 HBVDNA、HCV-RNA、HIV-RNA 濃度值與CT 值呈負相關，利用回歸方程計算值，將檢測CT 值轉換為濃度值，再建立質控框架，所得數據直觀，結果準確可靠。CT 值利用回歸方程計算濃度值經過正態性檢驗，均服從正態分布， 可以采用Levey-Jennings 作質控圖。筆者在更換試劑批號或質控品批號前20 次實驗采用即刻法， 只有HBV-DNA 能完成20 次的控制過程均為在控狀態，HCV-RNA 和HIV-RNA 在未能到20次， 均有失控狀態發生。 原因主要是DNA 標準品與RNA 標準品相比，DNA 有相對較好的穩定性、重復性和敏感性。 所以即刻法在本實驗室只適用于HBVDNA 的前20 次實驗的控制， 而HCV-RNA 和HIVRNA 不適用即刻法。 HCV-RNA 和HIV-RNA 前20次實驗采用預設固定框架（上一批號的均值和標準差），第21 次實驗以前20 次實驗數據為基礎建立質控框架。 根據檢測前20 個點結果計算HBV-DNA 的CV值 為17.92%，HCV-RNA 的CV 值 為30.77%，HIVRNA 的CV 值為23.82%。按照國家標準，酶免法的反應板內CV≤15%， 而常規IQC 的CV 可以達到30%左右[6]。所以根據此方法建立的質控框架有效。該實驗室的質控規則定為以質控值超過（X±2S）為警告限，超過（X±3S）為失控限，質控值10 個點在均值一側為失控。 從HBV-DNA 質控圖可以看出，L-J 質控圖上有4 次警告，提示有隨機誤差。HCV-RNA 質控圖有1次失控，10 個質控值均落在均值一側，提示可能存在系統誤差。需要采取糾正和預防措施改進實驗室的檢驗質量[7-8]。

由于數據的有限， 今后加大對檢測數據的驗證。該方法也有一定的局限性， 標準曲線的制作是關鍵。有好的標準曲線，是檢驗結果準確的基礎。