泥蚶抗菌物質的制備及其抗菌活性分析

劉 芳，陳慧玲，林宏宇

（寧德師范學院 生命科學學院，福建 寧德 352100 ）

寧德二都盛產貝類，當地盛產的泥蚶(Arca granosa) 因味道鮮美，被稱為“二都蚶”.泥蚶肉質細嫩有彈性，因富含血紅蛋白，故肉色鮮紅，熱水焯燙30 s 后即可鮮食，也可酒漬后食用，或曬制成干品.泥蚶隸屬于軟體動物門，具有藥用價值，傳統中醫認為泥蚶的殼具有消痰化瘀、制酸止痛的功效[1].研究表明，蚶肉中的蛋白質類化合物是其主要的藥效成分[2]，其藥效作用主要有抗癌、抗腫瘤、抗疲勞等.姚如永等[3-4]從泥蚶中分離出了具有抗腫瘤作用的海生素，張永娟等[5]研究發現泥蚶總蛋白具有抗疲勞作用，Ma 等[6]研究了抗菌肽（antimicrobial peptide，AMP）成為有效抗癌肽（anticancer peptides,ACP）的理化參數.

抗生素濫用導致食品中抗生素殘留、超級細菌出現、人體耐藥性提高等多種問題，開發安全、高效的抗生素替代品顯得尤為重要，從生物體內獲得天然的抗菌物質則是一個重要的研究方向.目前發現的難以產生耐藥性、安全的抗生素替代品主要有抗菌肽、寡聚糖、益生菌等，其可用于食品、飼料、醫藥等多種產品中.蚶肉中含有豐富的蛋白質和多肽，從蚶中分離出的活性蛋白及肽類已有約30 多種[2]，而目前關于泥蚶的抗菌肽研究較少.王素芳等[7]從泥蚶中分離純化出2 種血紅蛋白（Tg-HbⅠ和Tg-HbⅡ），且均對大腸桿菌和惡臭假單胞桿菌具有抗菌活性.王娟娟等[8]對泥蚶血紅蛋白酶解多肽的抗菌活性的研究結果表明，泥蚶多肽對副溶血弧菌、溶藻弧菌和哈維氏弧菌具有明顯抗菌活性.柯佳穎等[9]通過研究泥蚶凝集素的抑菌作用表明，凝集素對金黃色葡萄球菌具有一定的抗菌活性.楊婷婷[10]對泥蚶血紅蛋白及其多肽的抗菌功能的試驗結果表明，泥蚶血紅蛋白HbⅠ（血紅蛋白同源二聚體Ⅰ）、Hb II（血紅蛋白異源四聚體II）對大腸桿菌的MIC 分別為0.125 和0.375 mg·mL-1，對枯草芽孢桿菌的MIC 分別為6.25×10-3和4.69×10-3mg·mL-1，說明泥蚶血紅蛋白及其酶解多肽均具有不同程度的體外抗菌活性.Samaneh 等[10]通過研究水解黃鰭金槍魚副產物所制得的抗菌肽的抗菌活性，發現該抗菌肽對李斯特菌、葡萄球菌、大腸埃希菌和假單胞菌有一定的抗菌和抗氧化活性，并認為該抗菌肽可在營養保健品和功能性食品中用作抗菌和抗氧化劑成分.

以上研究表明，泥蚶中存在抗菌活性物質.因此，本研究以寧德二都地區盛產的泥蚶的軟組織為原料，通過酶解法制備抗菌物質，研究其最佳酶解參數，旨在探索海洋生物資源新物質，以期為推進海洋生物制品新產品的研究與開發提供參考.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

寧德二都泥蚶（購于寧德新華都購物廣場有限公司）、中性蛋白酶（Ruibio 公司）、大腸桿菌由寧德師范學院生命科學學院劉盛榮博士實驗室提供.

1.2 試驗設備

T6 新世紀紫外-可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）、B-400 型均質機（瑞士步琦）、YB-FD-18 型冷凍干燥機（上海億倍實業有限公司）、SW-CJ-1FD 型超凈工作臺（蘇州蘇凈安泰空氣技術有限公司）、DHP-9272A 型電熱恒溫培養箱（上海飛躍試驗儀器有限公司）、麥氏比濁管（溫州康泰生物科技有限公司）等.

1.3 試驗方法

1.3.1 抗菌物質的制備工藝 將新鮮的泥蚶洗凈、吐凈泥沙后取軟組織，用75%酒精消毒，加入適量無菌水勻漿，用中性蛋白酶在適宜條件下酶解，酶解結束后，迅速在95 ℃下水浴滅酶10 min，然后置于4℃、4 000 r·min-1條件下離心30 min，取上清液，減壓濃縮，凍干，得泥蚶抗菌物質凍干粉.

1.3.2 抗菌活性測定 采用比濁法測定抗菌活性[12-13].在3 個無菌三角瓶中分別加入25 mL 液體培養基，4 mL抗菌物質液體，1 mL 菌懸液（菌濃度1×104CFU·mL-1），以不加抗菌物質的三角瓶作為對照，充分混勻，將試管放入37 ℃恒溫培養箱中培養24 h 后，用紫外-可見光分光光度計在600 nm 波長處測定培養液的吸光值.

1.3.3 單因素試驗 采用單因素試驗，以抗菌活性為指標，研究酶解pH 值、溫度、時間、料液比對酶解法制備泥蚶抗菌物質的影響.

pH 值的選擇：酶解時間為3 h，溫度50 ℃，料液比1∶5，酶添加量為6 000 U·g-1，設置pH 值梯度為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，酶解后測定抗菌物質的抗菌活性，每個水平重復3 次.

溫度的選擇：酶添加量為6 000 U·g-1，料液比為1∶5，溶液的pH 值為7.0，酶解時間為3 h.將酶解溫度設置為30、40、50、60、70 ℃5 個梯度，酶解后測定抗菌物質抗菌活性，每個水平重復3 次.

時間的選擇：溫度為50 ℃，提取液的pH 值為7.0，料液比為1：5，酶添加量為6 000 U·g-1，設置時間梯度為1、2、3、4、5 h，酶解后測定抗菌物質的抗菌活性，每個水平重復3 次.

料液比的選擇：溫度為50 ℃，pH 值為7.0，酶添加量為6 000 U·g-1，酶解時間3 h；設置料液比梯度為1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7，酶解后測定抗菌物質的抗菌活性，每個水平重復3 次.

1.3.4 正交試驗 為了進一步優化酶解條件，在單因素結果的基礎上采用4 因素3 水平正交試驗對酶解pH 值、溫度、時間、料液比條件進行優化，以得到最佳酶解條件.試驗設計見表1.采用Minitab16 對正交試驗數據進行處理.

表1 正交試驗設計表

2 結果與分析

2.1 pH 值對抗菌活性的影響

圖1 反應了在不同pH 值環境下，中性蛋白酶作用于泥蚶軟組織后制備的抗菌物質的抗菌活性.對照組的吸光值為0.731，試驗組的吸光值均低于對照組，說明制備的抗菌物質對大腸桿菌具有抗菌活性.當pH 值過低或過高，抗菌活性均相對較差，這可能是由于過低或過高的pH 值環境降低了酶的活性或者使酶失活，導致不能充分酶解泥蚶軟組織，無法釋放泥蚶蛋白質中的活性肽段.當pH 值為7.5 時OD600最低，抗菌活性最佳.

圖1 不同pH 值環境制備的抗菌物質對大腸桿菌的抗菌活性

2.2 溫度對抗菌活性的影響

溫度過高或過低均對酶活性有影響，而且過高的溫度會使酶變性失活，過低的溫度使酶解反應速率過低，故合適的酶解溫度非常重要.由圖2 可知，試驗組的吸光值均低于對照組，當溫度在40～60 ℃范圍內，多肽的抗菌活性均相對較高.當溫度為50 ℃時，抗菌活性最佳.

圖2 不同酶解溫度制備的抗菌物質對大腸桿菌的抗菌活性

2.3 時間對抗菌活性的影響

由圖3 可知，酶解時間的長短影響抗菌物質對大腸桿菌的抗菌活性，當酶解時間為3 h 時，抗菌活性最佳.時間短，酶和蛋白質反應不夠充分，無法充分釋放泥蚶組織中的抗菌物質；時間過長，泥蚶軟組織中的蛋白質會被水解過度為氨基酸，因此有必要選擇合適的酶解時長.

2.4 料液比對抗菌活性的影響

料液比反應了底物濃度對酶促反應的影響，合適的底物濃度有利于酶促反應的進行.由圖4 可知，當料液比為1∶5 至1∶7 時，抗菌活性較好；當料液比為1∶6 時，抗菌活性最佳.

2.5 正交試驗設計與結果分析

根據單因素試驗結果，采用正交試驗對酶解條件進一步優化，試驗結果見表2.根據表2 可知，從抗菌活性來看，4 個因素的影響主次順序為pH 值＞溫度＞時間＞料液比.優組合為A1B2C3D2，即pH 值為7.0，溫度為50 ℃，酶解時間為4 h，料液比為1∶6.該組合不在正交試驗表中，經3 次驗證性試驗，結果表明該組合的抗菌活性平均值為0.358，低于正交試驗中不同酶解條件下制備的抗菌肽的抗菌活性.

圖3 不同酶解時間制備的抗菌物質對大腸桿菌的抗菌活性

圖4 不同料液比制備的抗菌物質對大腸桿菌的抗菌活性

表2 正交試驗結果

3 討論

抗菌肽廣泛存在于細菌、病毒和各種動植物體內，是一種具有抗菌活性的小分子肽[14].因其不易使微生物產生抗藥性、大部分對宿主無害等優點受到關注.但因從天然材料中提取抗菌肽工藝復雜、成本昂貴，化學合成成本高，基因工程表達載體構建難，產量低等多種問題[15]，采用酶解法水解生物蛋白質，釋放生物體內蛋白質中具有抗菌活性的肽段，成為人們常用的研究方法.本研究表明，泥蚶軟組織最佳酶解條件為pH 值7.0，酶解溫度50 ℃，酶解時間4 h，料液比1∶6，此條件下制備的抗菌肽具有一定的抗菌活性.相較于王素芳等[7]、王娟娟等[8]直接利用泥蚶的血液提取抗菌物質，本研究不局限于泥蚶血液，而是采用了泥蚶的全部軟體組織，通過酶解法釋放蛋白質中具有抗菌活性的多肽，可獲得抗菌物質的范圍更廣.本研究重在初步探索海洋生物資源新物質，有助于推進海洋生物制品新產品的研究與開發，但尚處于探索階段，有待進一步深入研究.