南瓜實蠅氣味結合蛋白和4種小分子配體的分子對接

汪斌偉，柯 莎，李 珣，袁盛勇，孔 瓊，王傳銘，張曉媛，李秀芳，楊華芳

（紅河學院/云南省高校滇南特色生物資源研究與利用重點實驗室，云南蒙自 661199）

氣味結合蛋白（Odorant binding proteins，OBPs）是一種存在于昆蟲化學感受器官的水溶性酸性蛋白，是氣味分子和受體間的橋梁，在信息素識別、嗅覺信號傳導及運輸等具有重要作用，從而影響著昆蟲取食（雌雄蟲的趨性行為）、繁殖（配偶探求、交配和產卵）和天敵躲避等生理行為反應。[1-3]由于OBPs對氣味分子選擇具有相對專一性，且每一種OBP只能結合某一類別的氣味分子，是昆蟲嗅覺識別過程中的關鍵步驟。[4]而分子對接是研究小分子配體與大分子受體間相互作用的一種方法，可預測二者間的親和力、結合模式和結合情況，從而篩選出與大分子受體結合能力較強的小分子配體。[5]該技術已被應用于多個領域，如生物大分子的修飾、藥物設計、昆蟲嗅覺機制等方面。[6-8]

南瓜實蠅Bactrocera tau(Walker)是一種重要的檢疫性害蟲，分布于我國的東南沿海、華中、華南、西南等地區，其寄主廣泛，危害嚴重。[9]目前該害蟲防治仍靠化學方法，且根據昆蟲寄主揮發物篩選出的干擾劑在害蟲防治上也得到了廣泛應用。本文通過同源建模預測南瓜實蠅OBPs的三維結構，運用分子對接技術對南瓜實蠅OBP2、OBP8、OBP9的三維結構與4種小分子配體（十七烷、十八烯、D-香茅醇、D-檸檬烯）之間的相互作用和結合能力進行分析，為了解南瓜實蠅OBPs與揮發性氣味分子之間的作用機制，并篩選出結合力較強的揮發物，為南瓜實蠅的田間防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

利用本課題組的前期研究結果克隆鑒定出的南瓜實蠅氣味結合蛋白基因OBP2、OBP8、OBP9的序列（GenBank登錄號分別為：KT716322.1、KT716317.1、KT716318.1）和4種小分子配體（十七烷、十八烯、D-香茅醇、D-檸檬烯）的三維模型為試驗材料；同源建模采用SWISS-MODEL在線服務程序構建，ChemBio3D軟件進行優化；分子對接采用SYBYL軟件等。

1.2 方法

1.2.1 南瓜實蠅OBPs三維模型構建及配體分子三維結構的優化

通過ExPASy平臺中的SWISS-MODEL程序在線搜索與南瓜實蠅OBP2、OBP8、OBP9相似度較高的模板，將南瓜實蠅OBPs序列與模板蛋白序列比對，選擇同源性較高的模板進行三維建模，再對其三維模型進行去除H2O、加H和添加缺失原子等優化處理。[10]同時通過Pubchem在線數據下載十七烷、十八烯、D-香茅醇和D-檸檬烯這4種揮發性物質的三維結構，并運用ChemBio3D對十七烷、十八烯、D-香茅醇、D-檸檬烯進行立體空間結構構建和最小能量優化。[11]

1.2.2 分子對接

本文采用柔性方式進行分子對接，即用SYBYL軟件對南瓜實蠅OBP2、OBP8、OBP9和十七烷、十八烯、D-香茅醇、D-檸檬烯分別進行空間結構對接，通過Surflex-docking模塊，使用原型分子(protomol) 為結合口袋，根據參數Threshold值和Bloat值確定其結合口袋形狀及大小，找到南瓜實蠅OBPs與配體分子的最優構想和結合模式進行對接，得到打分函數。[12]

2 結果與分析

2.1 同源建模

2.1.1 南瓜實蠅3個OBP的三維模型

基于氨基酸序列和結構一致性的同源檢索，發現南瓜實蠅OBP2、OBP8、OBP9三者的匹配度分別為30.97%、30.09%和46.28%，相似性均大于30%，可用于下一步試驗.經構建空間構像模型發現，OBP2、OBP8和OBP9三維模型分別有91.94%、92.92%和95.12%的氨基酸殘基處于最佳區域，且最佳區域均大于90%，說明南瓜實蠅OBP2、OBP8、OBP9三個蛋白的模型比較合理，在空間上也具有傳統的6個α螺旋結構，符合OBPs的保守結構特征，并對其進行優化處理得到3個南瓜實蠅OBPs的三維模型，具體見圖1，保存用于分子對接。

圖1 南瓜實蠅OBP2、OBP8、OBP9三級結構預測圖

2.1.2 配體分子的三維結構下載及優化

通過查詢十七烷、十八烯、D-香茅醇和D-檸檬烯4種小分子配體的CAS號，使用Pubchem數據庫下載其三維結構（見表 1），運用ChemBio3D對十七烷、十八烯、D-香茅醇、D-檸檬烯進行立體空間結構構建和最小能量優化，4種小分子配體的三維結構具體見圖 2。

表1 4種小分子配體的相關信息

圖2 4種小分子配體的三維結構

2.2 分子對接

2.2.1 南瓜實蠅OBP2分子對接

南瓜實蠅OBP2的空間對接結構（圖 3）與4種小分子配體對接效果如圖 4-A、B、C、D，當CSCORE值≥4時，crash越接近于0，polar越大，說明對接結果與實驗相似度較高，對接結果較好，反之對接結果不可靠。由表2可知，OBP2與D-香茅醇對接CSCORE值為4，綜合打分函數為4.2322，OBP2與D-檸檬烯對接CSCORE值為4，綜合打分函數為3.1346，對接結果有效，且結合模式較優；但OBP2與十七烷和十八烯的CSCORE對接值僅為1，打分函數分別為4.0986、3.6238，對接結果不可靠.綜上表明D-香茅醇、D-檸檬烯可與南瓜實蠅OBP2相結合，但D-香茅醇的結合作用優于D-檸檬烯（因為D-香茅醇的polar值高于D-檸檬烯的polar值），因此這2種小分子物質可作為該昆蟲的行為干擾劑。

表2 南瓜實蠅OBP2與4種小分子配體的對接情況

圖3 南瓜實蠅OBP2 空間結構

圖4 南瓜實蠅OBP2與4種小分子配體的對接圖

2.2.2 南瓜實蠅OBP8分子對接

通過分子對接發現南瓜實蠅OBP8的空間結構（圖5）可與4種小分子配體進行對接（對接效果如圖6-A、B、C、D），發現OBP8與D-香茅醇和十七烷的對接CSCORE值為4，且綜合打分函數均高于4，因此對接結果有效，結合模式較優.而OBP8與D-檸檬烯和十八烯的對接CSCORE值分別為3和1，均低于4，綜合打分函數也低于4，對接結果不可靠（表3）。綜上表明D-香茅醇、十七烷能與南瓜實蠅OBP8相互作用，但D-香茅醇的作用優于十七烷（因為D-香茅醇的polar值高于十七烷的polar值，crash值更接近于0），因此這2種小分子配體可作為該昆蟲的行為干擾劑使用。

表3 南瓜實蠅OBP8與4種小分子配體的對接情況

圖5 南瓜實蠅OBP8空間結構

圖6 南瓜實蠅OBP8與4種小分子配體的對接圖

2.2.3 南瓜實蠅OBP9分子對接

南瓜實蠅OBP9的三維模型空間對接結構如圖7，其與4種小分子配體的對接效果如圖8-A、B、C、D。由表4可知，OBP9與D-香茅醇、十七烷的對接CSCORE值均為4，綜合打分函數均高于4，對接結果有效，且結合模式較優；且由于D-香茅醇的polar值較大，crash值更接近于0，因此D-香茅醇與OBP9的結合作用更為緊密，表明這2種小分子配體都可以作為該昆蟲的行為干擾劑.而OBP9與D-檸檬烯和十八烯的對接CSCORE值較低，對接結果不可靠，相互間作用較小。

表4 OBP9與4種小分子配體的對接情況

圖7 南瓜實蠅OBP9空間結構

圖8 南瓜實蠅OBP9 與4 種小分子配體的對接圖

3 小結與討論

在已知OBPs序列的昆蟲中，利用NCBI尋找近源種的OBPs基因序列，通過同源建模和分子對接后，可初步篩選得到與之結合的小分子配體物質和探尋該類蛋白的結合特性等內容，該方法已被應用于茶尺蠖（Ectropis obliqua）、紫榆葉甲（Ambrostoma quadriimpressum）、苜蓿盲蝽（Adelphocoris lineolatus）等昆蟲OBPs的結合特性研究中。[7，8，13]一般情況下，同源性大于30%時所得到的模型就是可靠的三維模型。[14]而本實驗對南瓜實蠅OBP2、OBP8、OBP9的同源建模后的同源性均大于30%，可以開展分子對接實驗。

氣味結合蛋白（OBPs）是昆蟲識別外界氣味物質的特異性蛋白，大量研究發現昆蟲對氣味的趨向行為與OBPs有關，不同昆蟲的OBPs能與不同揮發物質結合，且具有不同的生理功能。[15-17]不同種類的昆蟲其OBPs與之對接的配體不同，且這些配體物質的作用也不盡相同.如蛾周氏嚙小蜂（Chouioia cunea）OBP1能與γ-丁內酯、鄰苯二甲酸二甲酯和萘結合，這3種寄主揮發物對該蟲有明顯的趨避作用。[14，18]而斑翅果蠅（Drosophila suzukii）OBP56h 能與β-環檸檬醛（該物質是草莓葉片產生的一種揮發性氣味物質）結合，且對該蟲具有吸引作用，同時該蛋白與苦味化合物中的鹽酸小蘗堿及香豆素的結合親和性較強，但不能與苯甲地那銨、N-苯基硫脲結合。[19-20]本文研究發現，南瓜實蠅OBP2與D-香茅醇、D-檸檬烯結合較好，OBP8與D-香茅醇、十七烷結合效果較好，而OBP9與D-香茅醇、十七烷對接效果較好，因此十七烷、D-香茅醇和D-檸檬烯可作為南瓜實蠅田間防治中的昆蟲行為干擾劑使用，但具體干擾作用是引誘還是趨避還需進一步研究。