誘導煙草抗灰霉病的茉莉酸甲酯有效濃度篩選

李林倩，余朝陽，陳 業，張秀榆，孔 瓊，袁盛勇，薛春麗，陶宏征

（紅河學院/云南省高校滇南特色生物資源研究與利用重點實驗室，云南蒙自 661199）

煙草灰霉病是由灰葡萄孢（Botrytis cinerea）引起的真菌性病害，主要危害苗期和大田期的煙葉。當濕度較大時，葉片和幼莖密生有灰色霉層，嚴重時發病率可達100%。[1-2]該病目前仍以化學防治為主，但由于灰葡萄孢變異大、易產生抗藥性等特點使化學防效較低，且化學藥劑的大量使用不僅造成環境污染，還降低煙草品質。[3]因此開展煙草灰霉病的綠色防控尤為重要。而植物誘導抗性因其抗病的系統性、持久性和廣譜性等優點，已成為防治植物病害的新思路。

茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate，MeJA）作為一種植物激素信號分子廣泛存在于植物體中，外源利用能誘導植物產生化學防御，激發相關基因表達。[4]大量研究發現MeJA與植物抗病性有相關性，且參與了植物局部或系統抗性[5]，施用外源MeJA能誘導植物對病原真菌、細菌、線蟲產生抗病性，如誘導紫花苜蓿抗根腐病（Fusarium oxysporum）[6]、誘導辣椒抗青枯病（Ralstonia solanacearum）[7]、也能提高番茄果實對鏈格孢霉（Alternaria solani）等病原菌的侵染。[8]因此，本研究以MeJA為外源誘導物，篩選出對煙草灰霉病具有較好抗性的最佳濃度、持效期和接種時間，以期為茉莉酸甲酯指導煙草灰霉病防治提供理論數據。

1.材料與方法

1.1 材料

煙草BY-2品種和灰葡萄孢菌種均保存于紅河學院生命學院305室。灰霉菌培養采用PSA固體培養基進行暗培養，溫度為24±1℃，7d后取菌落邊緣的菌絲塊用于菌絲生長試驗，同時收集孢子進行孢子懸浮液制備。煙草先用漂浮育苗后移栽，直至煙苗長為7葉1心期時接種使用。茉莉酸甲酯（北京索萊寶科技有限公司）先用少量無水乙醇溶解，再用無菌水配成所需濃度，濃度梯度為0.01mM、0.05 mM、0.1 mM、0.5 mM、1 mM。

1.2 方法

1.2.1 MeJA對灰葡萄孢的影響

分別測定了不同濃度茉莉酸甲酯對灰葡萄孢菌孢子萌發和菌絲生長的影響。（1）將上述5個濃度梯度的MeJA孢子懸浮液置于24±1℃暗培養，每隔12h觀察孢子的萌發情況，連續觀察3次，統計孢子萌發率，以滅菌水為對照。（2）PSA固體培養基制成含MeJA分別為上述5個濃度梯度的平板，對照為不含MeJA的PSA平板。平板中央接入直徑為6mm菌絲塊，于24±1℃暗培養，5d后測量菌落直徑，計算抑菌率，每個處理3次重復。抑菌率（%）=（對照菌落生長量-處理菌落生長量）/對照菌落生長量×100 %。結果采用SPSS17.0進行顯著性分析。

1.2.2 MeJA誘導煙草抗灰霉病的最佳濃度篩選

于不同濃度MeJA溶液中加入0.05%（V/V）Tween-80，再用噴霧器將不同濃度MeJA溶液噴施于煙草葉片上（葉片正反面均勻噴霧，藥液不流淌為宜），對照僅用無菌水和0.05%（V/V）Tween-80噴霧處理。12 h后用濃度為1×106個/mL灰葡萄孢孢子懸浮液噴施于上述處理的煙草葉片（葉片正反面均勻噴霧，孢子液不流淌為宜），接種后避光保濕24h，并置于溫度25±2℃和濕度為85%人工氣候箱中培養，于第10d調查灰霉病發病情況，根據表1進行分級[9]，計算病情指數和誘抗效果，每個處理調查5個葉片，3次重復。

表1 灰霉病病斑的分級標準

公式為：病情指數＝（∑病級葉數×該病級值／調查總葉片數×最高級數值）×100

誘抗效果＝（對照病情指數－處理病情指數）／對照病情指數×100%

1.2.3 MeJA處理后誘導期及抗灰霉病持久性的測定

根據1.2.3結果，于MeJA溶液最佳濃度處理后每天噴上濃度為1×106個/mL灰葡萄孢孢子懸浮液于煙草葉片，葉片正反面均勻噴霧，液體不流淌為宜，接種后避光保濕24h，并置于溫度25±2℃和濕度為85%人工氣候箱中培養，接種8d后調查發病情況，進行病情指數和誘抗效果計算，確定最佳誘導期及持久性。每個處理調查5個葉片，3次重復。

2 結果與分析

2.1 茉莉酸甲酯對灰葡萄孢生長的影響

由圖1可以看出，灰葡萄孢孢子在5個MeJA濃度下均能萌發和生長，各處理差異不顯著（p＜0.05）。在處理后的12-36 h間，灰葡萄孢孢子隨著時間延長，其孢子萌發率隨之增高，且于36h達到最大值；且在同一MeJA濃度處理下，不同時間下的孢子萌發率差異不顯著。同時灰葡萄孢菌絲塊在含有不同濃度MeJA生長5d后，各處理間菌落抑制率不顯著（見圖1中的抑制率）。因此表明，MeJA對灰葡萄孢生長無影響。

圖1 不同濃度MeJA對灰葡萄孢孢子萌發和菌絲生長的影響

2.2 不同濃度MeJA對煙草抗灰霉病誘抗效果

通過活體接種試驗，沒有噴施MeJA煙草植株葉片發病率最高達100 %。病斑初期呈水漬狀，接著迅速擴展，最后形成黃褐色且邊緣不規則的輪紋。不同濃度MeJA處理后，均能不同程度地降低煙草灰霉病的病情指數，且在濃度為0.01-0.50mM處理后能有效誘導煙草對灰葡萄孢菌產生抗性。但不同濃度MeJA產生的誘抗效果不同，其中0.1mM MeJA處理后的誘抗效果最好，高達52.29%，病情指數顯著低于對照和其它濃度下的處理（見表2）。但是當MeJA為1mM時，煙草灰霉病的病情指數與對照相等，沒有表現出誘抗效果，表明MeJA誘導煙草抗灰霉病的濃度并不是越高越好。

表2 不同濃度茉莉酸甲酯處理對煙草灰霉病的影響

2.3 MeJA誘導煙草抗灰霉病的最佳間隔期和持久期

在最佳MeJA濃度（0.1mM）處理下，連續8d觀測了煙草灰霉病的病情指數，并進行誘抗效果統計。根據圖2結果，發現處理時間不同，其發病情況和誘導抗病效果也不一樣；在處理后1-4d間，灰霉病的病情指數逐漸降低且誘抗效果增加，其中第4d誘抗效果最好，病斑最小，病情指數最低；而處理后5-8d，灰霉病的病情指數又急速增加，且于第8d無誘抗效果。因此用0.1mM MeJA誘導煙草抗灰霉病的最佳間隔期為4d；而但處理間隔8d時，幾乎無誘抗效果，這說明MeJA誘導煙草抗灰霉病的持久期可達7d左右。

圖2 不同誘導時間下的煙草灰霉病病情指數和誘抗效果

3 小結與討論

茉莉酸甲酯（MeJA）作為一種抗逆信號物質，能提高植物抗病害的能力。[10]但其誘導抗性高低與寄主植物品種、病害種類和茉莉酸甲酯濃度相關。當采用不同濃度MeJA噴霧辣椒幼苗后，0.1 mM 能明顯誘導粵紅1號幼苗抗青枯病（Ralstonia solanacearum），0.05mM對辛香8號的誘導效果最好[7]。而在紫花苜蓿根腐病（Fusarium oxysporum）的防治試驗中，其根腐病病情指數的高低與外源MeJA濃度、紫花苜蓿品種和誘導時間相關，其中MeJA 濃度是主要因素，但MeJA濃度為0.1mg/mL時抑制效果最佳。[6]當用1g/mL MeJA噴霧4葉期的煙草幼苗后，該處理能提高幼苗抗炭疽病（Colletotrichum destructivum）的能力。[5]

本文通過茉莉酸甲酯5個不同濃度對煙草灰霉病誘抗檢測發現，當噴施外源不同濃度茉莉酸甲酯均能不同程度減低煙草灰霉病的發生，而不是直接的抑菌作用；MeJA濃度為0.1 mM時，病斑最小，煙草灰霉病的病情指數最低，誘抗效果最高為（52.29±3.13）%；當0.1 mM MeJA處理后第1d就表現出誘抗效果，且持續至第7d，這說明MeJA對誘導煙草產生抗性有著較好持久性。尤其噴施后的第4d，煙草葉片的病斑最小，病情指數最低，同時表現出最大的誘抗效果為69.90%。因此，MeJA誘導煙草灰霉病的最佳間隔期是4d，持久期可達7d左右，且植物誘導抗性的產生需要一定時間，在煙草灰霉病的大田防治中，需要在病害發生之前噴施MeJA才能起到較好的防治作用。