17%吡唑醚菌酯·氟環唑懸浮劑的高效液相色譜分析方法

何培迎，陳宏祥，仲春梅

(江蘇藍豐生物化工股份有限公司，江蘇 新沂 221400)

氟環唑是一種內吸性三唑類殺菌劑，能抑制病菌麥角甾醇合成，阻礙病菌細胞壁的形成，并且氟環唑分子對一種真菌酶具有強力親和性，與目前已知殺菌劑相比，能夠有效抑制麥角甾醇合成[1]。還可提高作物幾丁質酶活性，導致真菌吸氣收縮，抑制病菌侵入，這是氟環唑在所有三唑類產品中獨一無二的特性。吡唑醚菌酯對病原真菌的線粒體呼吸具有抑制作用，即通過在細胞色素合成中阻止電子轉移抑制線粒體的呼吸，干擾細胞能量供給，使細胞死亡，從而發揮殺菌作用。對幾乎所有真菌類(子囊菌綱、擔子菌綱和半知菌類)病害都顯示出很好的活性。具有保護和治療作用，并有良好的滲透和內吸作用[2]。

吡唑醚菌酯·氟環唑懸浮劑作為一種新型廣譜復配殺菌劑，對大田作物、水果、蔬菜的多種病害兼具治療、鏟除作用，尤其對小麥赤霉病、銹病的防治效果顯著、持效期長，對小麥安全，應用前景廣闊。目前，關于氟環唑、吡唑醚菌酯以及其他復配制劑的檢測方法均有報道[3-6]，但有關17%吡唑醚菌酯·氟環唑復配制劑的高效液相色譜分析方法未見報道。本文建立的HPLC方法，以甲醇+0.2%磷酸水溶液為流動相，采用Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱和可變波長紫外檢測器，對有效成分吡唑醚菌酯和氟環唑同時分離、定量。該方法可供檢測機構和企業分析室人員監督和把控吡唑醚菌酯·氟環唑復配制劑的質量時作參考。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑 島津高效液相色譜儀LC-20A，可變波長紫外檢測器，色譜工作站；甲醇(HPLC)；超純水制備系統；吡唑醚菌酯(99.0%)標樣和氟環唑(99.0%)標樣，國家農藥質量監督檢驗中心(沈陽)。17%唑醚·氟環唑懸浮劑。

1.2 色譜條件 色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18不銹鋼柱(250mm×4.6mm，粒徑5μm)；檢測波長235nm，流動相：ψ(甲醇+0.2%磷酸水溶液)=75+25；流速：1.0mL/min；進樣體積10μL；柱溫：室溫(溫差變化≤2℃)；保留時間：氟環唑約6.9min；吡唑醚菌酯約9.5min(圖1、圖2)。

圖1 吡唑醚菌酯和氟環唑對照品高效液相色譜圖

圖2 17%吡唑醚菌酯·氟環唑懸浮劑試樣高效液相色譜圖

1.3 測定步驟

1.3.1 標樣溶液配制 在50mL容量瓶中，稱取0.06g吡唑醚菌酯標樣、氟環唑標樣0.03g(均精確至0.000 1g)置于同一50mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。用移液管準確吸取上述溶液5mL，置于50mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，過濾(0.45μm微孔濾膜)，濾液備用。

1.3.2 試樣溶液的配制 稱取0.5g被試物(精確至0.000 1g)置于50mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。用移液管準確吸取上述溶液5mL，置于50mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，過濾(0.45μm微孔濾膜)，濾液待測。

1.3.3 測定 當儀器基線穩定后，在優化的試驗條件下，使標樣溶液連續進樣，直至相鄰2針吡唑醚菌酯(或氟環唑)峰面積的相對變化<1.2%后，再按照標樣溶液、被試物溶液、被試物溶液、標樣溶液的順序進行測定。

1.3.4 計算 將試驗測得的2針被試物溶液以及前后2針標樣溶液中吡唑醚菌酯(或氟環唑)的峰面積分別進行平均。被試物中吡唑醚菌酯(或氟環唑)的質量分數ω(%)按式(1)計算：

(1)

式中：

A1——標樣溶液中，吡唑醚菌酯(或氟環唑)峰面積的平均值；

A2——試樣溶液中，吡唑醚菌酯(或氟環唑)峰面積的平均值；

m1——吡唑醚菌酯(或氟環唑)標樣的質量，g；

m2——試樣的質量，g；

ω——標樣中吡唑醚菌酯(或氟環唑)的質量分數，%；

2 結果與分析

2.1 色譜條件選擇

2.1.1 色譜分離條件選擇 試驗過程中，反復比對被試物吡唑醚菌酯和氟環唑與標樣在波長190～400nm范圍內的紫外吸收光譜曲線，同時考慮溶劑峰、雜質峰干擾以及各組分的靈敏度、分離度和數據穩定性，最終確定最適檢測波長為235nm。

2.1.2 色譜柱及流動相的選擇 為保證快速檢測有效成分吡唑醚菌酯和氟環唑且峰形良好，選擇150mm×4.6mm：Agilent ZORBAX XDB-C18不銹鋼柱和250mm×4.6mm：AgilentEclipse XDB-C18不銹鋼柱分別進行研究，采用不同比例的甲醇-水和乙腈-水作為流動相，均未得到良好的分離度。經分析比較，發現在酸性條件下被測組分相對穩定。添加不同濃度的冰乙酸和磷酸，最終選擇250mm×4.6mm AgilentEclipse XDB-C18不銹鋼柱，并采用磷酸作為減尾劑，確定流動相為甲醇+0.2%磷酸水溶液(體積比75+25)，流量為1.0mL/min。該測定保留時間適中，實現吡唑醚菌酯和氟環唑的有效分離，且峰形良好。

2.2 線性相關性 配制不同質量濃度的標樣溶液，在優化的色譜分離條件下進行測定。橫坐標為吡唑醚菌酯(氟環唑)的質量濃度，縱坐標為其峰面積值。二者線性回歸方程和相關系數分別為：Y吡唑醚菌酯(氟環唑)=1E+08x，r=0.999。吡唑醚菌酯定量線性關系在0.1～0.6mg/mL質量濃度下良好；氟環唑定量線性關系在0.02～0.25mg/mL質量濃度下良好結果，(圖3、圖4)。

圖3 吡唑醚菌酯線性關系圖

圖4 氟環唑線性關系圖

2.3 方法的精密度 試驗采用5批次的被試物17%吡唑醚菌酯·氟環唑懸浮劑，連續重復測定5次，研究了定量分析方法的精密度，結果(表1)。吡唑醚菌酯和氟環唑的變異系數分別是0.65%和0.51%，滿足被試物定量分析的要求。

表1 精密度測定

2.4 方法的準確度 試驗采用產品空白制劑中添加不同濃度的吡唑醚菌酯和氟環唑標樣的方法，配制5份與被試物相近的模擬樣品，開展添加回收率試驗，研究方法的準確度。試驗數據表面吡唑醚菌酯添加回收率為99.70%～99.96%，氟環唑添加回收率為99.20%～99.78%，兩者平均回收率分別為99.78%和99.45%(表2)，準確度較高，可以滿足定量分析要求。

表2 準確度測定數據

2.5 特異性鑒定 按照1.3.1/1.3.2所述方法配制標準溶液和樣品溶液，在1.2操作條件下采用HPLC-DAD峰純度分析法對氟環唑、吡唑醚菌酯進行鑒別，特異性典型譜圖(圖5、圖6)。由譜圖可知，氟環唑、吡唑醚菌酯在該分析方法下對紫外光有較強的吸收信號。從色譜圖可以清晰的看出，有效成分氟環唑、吡唑醚菌酯處無其他物質干擾，符合定量分析要求。

圖5 氟環唑特異性鑒定

圖6 吡唑醚菌酯特異性鑒定

2.6 非分析物干擾的判定 在評價準確度時，需要包含非分析物質干擾試驗，因為助劑中的任何干擾物均會導致分析方法出現系統偏差，分析時同時測定不帶助劑的原藥和空白樣品，證明其無相互干擾，并提交相關色譜圖。通過不加助劑的原藥色譜圖和空白樣品色譜圖判定，非分析物對有效成分氟環唑、吡唑醚菌酯的分析不構成干擾，相關非分析物質干擾典型譜圖(圖7～圖9)。

圖7 空白樣品圖8 氟環唑

圖9 吡唑醚菌酯

3 結論

綜上，本文建立的HPLC分析方法，保留時間合理，精密度與準確度較高，可快速分離及測定吡唑醚菌酯·氟環唑制劑中兩種有效成分的含量，且線性相關性好，適用于檢測機構和企業分析室對吡唑醚菌酯·氟環唑復配制劑質量的監督與把控。