丹參水溶性成分治療冠心病的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

吳雨泉，王一碩，2，3，杜紫微，李佳珍，劉沁榮，石延榜，2，3

（1.河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，鄭州 450046；2.河南省中藥生產(chǎn)一體化工程技術(shù)研究中心，鄭州 450046；3.河南省夏枯草培優(yōu)工程技術(shù)研究中心，河南 駐馬店 463000）

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化型心臟病，也稱冠心病（coronary heart disease，CHD），多發(fā)于中老年人群，具有較高的病死率和病殘率［1］，其發(fā)病機(jī)制在于冠狀動(dòng)脈血管發(fā)生粥樣性硬化，進(jìn)而造成血管阻塞，引起心肌缺血缺氧性壞死［2］，導(dǎo)致胸悶氣短、血壓下降、心絞痛、甚至休克死亡，給人們的生命健康和生活質(zhì)量帶來嚴(yán)重的負(fù)面影響。

然而，我國醫(yī)學(xué)認(rèn)為此病屬“胸痹、真心痛”范疇，病位在心，多因氣血不暢、瘀血積滯、痰濁阻塞、正氣虧虛所致，屬“陽微陰弦”的本虛標(biāo)實(shí)之證［3］。治法多以活血祛瘀，行氣導(dǎo)滯為主。丹參作為舒張血管的代表藥，用于臨床上多種心血管疾病。現(xiàn)代研究表明，丹參水溶性成分具有較好的活血化瘀功效，對(duì)于多種心血管疾病都有不同程度的治療作用［4-6］，但其作用機(jī)制與物質(zhì)基礎(chǔ)還存在很大的發(fā)掘空間。本研究通過生物信息技術(shù)、多向藥理學(xué)、網(wǎng)絡(luò)分析等融為一體的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，針對(duì)丹參水溶性成分治療CHD的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行先驗(yàn)性探究，以期為臨床診療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1）成分與靶標(biāo)的確定

通過CNKI查閱文獻(xiàn)，搜集丹參水溶性成分；把所收集到的成分在Pubchem（https：／／pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）數(shù)據(jù)庫中下載其化學(xué)結(jié)構(gòu)式，保存為“SDF”格式。對(duì)于數(shù)據(jù)庫中缺少的化學(xué)結(jié)構(gòu)，則通過化源網(wǎng)（www.chemsrc.com）、化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)庫（www.organchem.csdb.cn）搜索其結(jié)構(gòu)式，并于Chembiodraw軟件中手動(dòng)畫取，保存為“CDX”格式；將所有的化學(xué)結(jié)構(gòu)式導(dǎo)入SwissTargetPrediction（www.sib.swiss）數(shù)據(jù)庫，預(yù)測其作用靶點(diǎn)。

2）成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與拓?fù)浞治?/p>

將上述獲得的成分與靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件，構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)；利用“Analysis network”工具對(duì)該網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治觯訢egree值表示重要節(jié)點(diǎn)，其值越大，表明在網(wǎng)絡(luò)中越重要。

3）維恩分析藥物成分-CHD疾病的交集靶點(diǎn)

以“Coronary heart disease”為關(guān)鍵詞，在Genecards、DisgeNET 2個(gè)數(shù)據(jù)庫中檢索CHD疾病靶點(diǎn)，分別通過中位數(shù)，篩選“relevance score”“DIS”值，以獲得相關(guān)度高的靶點(diǎn)信息。將2個(gè)數(shù)據(jù)庫提取的信息合并，刪除重復(fù)項(xiàng)后保存；將成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)導(dǎo)入Venn在線繪圖工具（http：／／bioinformatics.psb.ugent.be／webtools／Venn）獲得交集靶點(diǎn)。

4）PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與核心靶點(diǎn)的篩選

通過String數(shù)據(jù)庫（https：／／string-db.org）分析互作靶點(diǎn)，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，將基因?qū)隒ytoscape3.7.2軟件中進(jìn)行可視化分析，并根據(jù)Degree值篩選核心靶點(diǎn)。

5）靶點(diǎn)的GO及KEGG通路富集分析

將上述獲得的核心靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫（https：／／Metascape.org），限定物種選擇 “人類”，對(duì)其進(jìn)行GO生物功能富集分析，包括生物過程（biological process，BP）、細(xì)胞組成（cell composition，CC）、分子功能（molecular function，MF）富集分析；同時(shí)KEGG通路富集分析也采用該數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析，綜合［1.4］項(xiàng)下核心靶點(diǎn)的生物學(xué)特性及調(diào)控通路；將上述得到的成分、靶點(diǎn)、通路導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，得到成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 成分與靶標(biāo)的獲取結(jié)果

丹參水溶性酚酸類成分多以丹參素、丹酚酸A、丹酚酸B、丹酚酸C、丹酚酸D、丹酚酸E、丹酚酸F、丹酚酸G、迷迭香酸、紫草酸、咖啡酸、原兒茶醛活性較高［7-8］，成分基本信息見表1；將成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)式導(dǎo)入Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫中，得到丹參素9個(gè)靶點(diǎn)，丹酚酸A35個(gè)靶點(diǎn)，丹酚酸B27個(gè)靶點(diǎn)，丹酚酸C43個(gè)靶點(diǎn)，丹酚酸D33個(gè)靶點(diǎn)，丹酚酸E16個(gè)靶點(diǎn)，丹酚酸F64個(gè)靶點(diǎn)，丹酚酸G45個(gè)靶點(diǎn)，咖啡酸56個(gè)靶點(diǎn)，迷迭香酸62個(gè)靶點(diǎn)，原兒茶醛16個(gè)靶點(diǎn)，紫草酸15個(gè)靶點(diǎn)，共得到421個(gè)靶點(diǎn)，將數(shù)據(jù)去重整合后共得到表1所示的175個(gè)預(yù)測靶點(diǎn)。

表1 12種丹參水溶性成分基本信息

2.2 成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與拓?fù)浞治?/h3>

將上述成分和靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。該網(wǎng)絡(luò)涉及187個(gè)節(jié)點(diǎn)（12個(gè)成分、175個(gè)靶點(diǎn)），421條邊，見圖1。圖中粉紅色三角形為成分，藍(lán)紫色多邊形為預(yù)測靶點(diǎn)。經(jīng)“analysis network”工具對(duì)該網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治觯@取Degree、Betweenness Centrality、Closeness Centrality等多個(gè)參數(shù)，圖形大小與顏色深淺與Degree值成正比。Degree中位數(shù)為2，Betweenness Centrality中位數(shù)為0.000 514 83，Closeness Centrality中位數(shù)為0.319 587 629。Degree大于兩倍中位數(shù)（≥4）的有44個(gè)節(jié)點(diǎn)，占23.5%。根據(jù)Degree值大小，排名前5位的成分有丹酚酸F、迷迭香酸、咖啡酸、丹酚酸G、丹酚酸C，排名前5位的靶點(diǎn)有MMP1、MMP9、FYN、CA2、CA7、CA12、CA4、AKR1B1、MMP2，基本信息見表2。

圖1 成分-靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

2.3 成分-疾病靶點(diǎn)的韋恩圖分析結(jié)果

以“coronary heart disease”為關(guān)鍵詞，在Dis-GeNET數(shù)據(jù)庫中查詢，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過CHD臨床試驗(yàn)的藥物靶點(diǎn)有1 078個(gè)，取“DIS”中位數(shù)（n≥0.545）后得到861個(gè)靶點(diǎn)；同時(shí)在Genecards數(shù)據(jù)庫中查詢到有關(guān)疾病候選靶點(diǎn)4 357個(gè)，通過“relevance score”取中位數(shù)（n≥10.93）篩選得到1 090個(gè)相關(guān)疾病靶點(diǎn)。將兩個(gè)數(shù)據(jù)庫得到的結(jié)果歸一整合，共得到1 873個(gè)疾病靶點(diǎn)。藥物與疾病的交集靶點(diǎn)共79個(gè)，提示這些靶點(diǎn)可能是丹參水溶性成分治療CHD的潛在靶點(diǎn)，見圖2。

表2 成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)的拓?fù)浞治鲂畔?/p>

圖2 成分-疾病的交集靶點(diǎn)韋恩圖

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)篩選

將79個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入String在線生物分析工具中，物種選擇為“人類”，分析其互作關(guān)系。網(wǎng)絡(luò)顯示共有79個(gè)節(jié)點(diǎn)，635條邊。根據(jù)Degree中位數(shù)（n≥14），選取核心靶點(diǎn)，如圖3。圖中顯示有43個(gè)節(jié)點(diǎn)，445條邊，節(jié)點(diǎn)的大小和顏色的深淺與Degree值成正比，邊的粗細(xì)代表Combine_score值的大小，邊越粗Combine_score值越大。Degree值排名前10位的關(guān)鍵靶點(diǎn)有PTGS2、CASP3、EGFR、MMP9、MAPK1、SRC、MAPK8、TLR4、JUN、STAT3，提示這些靶點(diǎn)可能是治療CHD的核心靶點(diǎn)。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 成分-疾病靶點(diǎn)的GO生物功能及KEGG信號(hào)通路富集分析

2.5.1 成分-疾病靶點(diǎn)的GO生物功能富集分析

將［2.4］項(xiàng)下的43個(gè)核心靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫，物種選擇為“人類”，共確定4 136個(gè)GO條目，（P＜0.01），其中BP有3 230個(gè)條目，主要涉及白細(xì)胞遷移（leukocyte migration）、積極調(diào)控細(xì)胞遷移（positive regulation of cell migration）、對(duì)受傷的反應(yīng)（response to wounding）、對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)（response to oxidative stress）等；CC有327個(gè)條目，主要涉及膜筏（membrane raft）、膜面（side of membrane）、細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix）、囊泡腔（vesicle lumen）等；MF有406個(gè)條目，主要涉及內(nèi)肽酶活性（endopeptidase activity）、激酶結(jié)合（kinase binding）、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合（protein domain specific binding）等。每項(xiàng)取校正P值前10位條目，如圖4所示。

2.5.2 成分-疾病靶點(diǎn)的KEGG信號(hào)通路富集分析

將［2.4］項(xiàng)下得到的43個(gè)核心靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫，限定物種為“人類”，對(duì)其進(jìn)行KEGG信號(hào)通路功能富集分析，共確定106個(gè)條目（P＜0.01），根據(jù)-log10（P）值的大小取前14位KEGG信號(hào)通路，見圖5。主要涉及癌癥的途徑（pathways in cancer）、內(nèi)分泌抵抗（endocrine resistance）、流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化（fluid shear stress and atherosclerosis）、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)（regulation of actin cytoskeleton）、腎素-血管緊張素系統(tǒng)（renin-angiotensin system）等。以上通路表明，12種丹參水溶性成分與治療CHD的作用密切相關(guān)，見表3。

圖4 成分-疾病靶點(diǎn)的GO生物功能富集分析

圖5 KEGG富集分析氣泡圖

表3 成分-疾病靶點(diǎn)的KEGG信號(hào)通路基本信息（前14條目）

2.5.3 成分-靶點(diǎn)-通路的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

根據(jù)上述的14條通路，包含36個(gè)靶點(diǎn)，涉及11個(gè)成分，將其導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件，構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路”的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。紅色圓形為丹參水溶性成分，綠色圓形為關(guān)鍵靶點(diǎn)，黃色圓形為關(guān)鍵通路，圖形面積大小和顏色深淺與Degree值成正比，如圖6所示。根據(jù)Degree值，排名前5位的靶點(diǎn)包括MMP9、MMP1、MMP2、EGFR、JUN。以上信息提示這些靶點(diǎn)可能是丹參水溶性成分治療CHD的重要靶點(diǎn)。

圖6 成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論與結(jié)論

傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)雖然并未給CHD命名，據(jù)其癥狀可歸屬為“胸痹、真心痛”范疇，病位在心，多因氣血不暢、瘀血積滯、痰濁阻塞、正氣虧虛所致。CHD多發(fā)人群為中老年人、高血壓患者、肥胖者、吸煙者、酗酒者等［9-11］，它是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的慢性演變過程，經(jīng)歷了血管功能失衡、血管損傷修復(fù)、血管重構(gòu)等過程［12］，最終導(dǎo)致心肌缺血，進(jìn)而引發(fā)心絞痛、胸悶、休克甚至死亡。在嚴(yán)重危害人們身心健康的同時(shí)，也給社會(huì)帶來了經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前丹參介入治療CHD已取得了較好的臨床研究進(jìn)展［13-16］。丹參作為我國傳統(tǒng)藥物，早在《神農(nóng)本草經(jīng)》［17］中就被列為上品，素有“心腹邪氣，腸鳴幽幽如走水，寒熱積聚，破癥除瘕，止煩滿，益氣”之說。現(xiàn)代研究表明，丹參水溶性酚酸類成分正是發(fā)揮活血化瘀作用的主要成分。經(jīng)文獻(xiàn)調(diào)查［7-8］，得到丹參活性較高的水溶性成分有12個(gè)，即丹參素、丹酚酸A、B、C、D、E、F、G、紫草酸、迷迭香酸、咖啡酸、原兒茶醛。

3.1 丹參水溶性成分“成分-靶點(diǎn)”治療CHD的作用探討

經(jīng)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，12種丹參水溶性成分涉及175個(gè)預(yù)測靶點(diǎn)；通過DisGeNET、Genecards兩個(gè)數(shù)據(jù)庫排查去重后得到1 873個(gè)疾病靶點(diǎn)，成分與疾病交集靶點(diǎn)79個(gè)，經(jīng)過PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，選取核心靶點(diǎn)43個(gè)。

3.1.1 丹參水溶性成分治療CHD潛在的關(guān)鍵成分分析

依據(jù)表2網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)浞治霭l(fā)現(xiàn)，Degree排名前五的成分分別是丹酚酸F、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸G、丹酚酸C。

迷迭香酸是一種天然多酚物質(zhì)，具有抗氧化、抗炎活性。已有研究表明，盡管在高糖環(huán)境下，迷迭香酸仍然可通過改善線粒體功能并激活STAT3（信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3）來抑制高葡萄糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡［18］，這可能是緩解冠心病心肌受損的重要途經(jīng)［19］。Luciana G F等研究表明迷迭香酸可促進(jìn)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶活性降低，有選擇性地降低血壓［20］，一定程度上對(duì)冠心病并發(fā)高血壓患者有潛在的治療意義［21］。

咖啡酸是羥基肉桂酸的重要成員，具有天然的抗氧化劑和心臟保護(hù)特性［22］。Vacaresse N等［23］認(rèn)為氧化低密度脂蛋白（oxLDL）在動(dòng)脈粥樣硬化中起主要作用，咖啡酸可阻斷oxLDL誘導(dǎo)的EGFR激活，從而阻斷了細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的生成。

丹酚酸C由兩分子丹參素縮合而成。Wu P等［24］研究發(fā)現(xiàn)丹酚酸C對(duì)MMP2和MMP9的活性具有明顯的抑制作用，并能維持主動(dòng)脈結(jié)構(gòu)的完整性，保護(hù)彈性蛋白免于碎裂，這對(duì)治療主動(dòng)脈病變有積極的作用。

3.1.2 丹參水溶性成分治療CHD潛在的關(guān)鍵靶點(diǎn)分析

根據(jù)PPI提取的核心靶點(diǎn)，得到度值排名前10位 的 靶 點(diǎn) 有PTGS2、CASP3、EGFR、MMP9、MAPK1、SRC、MAPK8、TLR4、JUN、STAT3，提示這些靶點(diǎn)為丹參水溶性成分治療CHD的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

PTGS2（前列腺素-內(nèi)過氧化物合酶2）受多種炎性細(xì)胞調(diào)節(jié)而高度表達(dá)，李楊等［25］推測活血化瘀類中藥可能與下調(diào)PTGS2基因表達(dá)水平有關(guān)，從而起到抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用。MAPK1、MAPK8同屬絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族，有研究發(fā)現(xiàn)miR-378通過調(diào)節(jié)p38 MAPK和STAT3信號(hào)通路從而抑制心肌纖維化［26］。MMP9為基質(zhì)金屬肽酶（MMPS）家族成員，它是一類復(fù)雜的內(nèi)肽酶（鋅依賴性蛋白酶），其活性異常會(huì)影響心肌重塑、心肌纖維化、心肌細(xì)胞凋亡等過程，在心血管生理和病理中起重要作用，參與心肌細(xì)胞外蛋白質(zhì)合成和降解的調(diào)控［27］。EGFR（表皮因子受體）參與細(xì)胞增殖、分裂和周期調(diào)控等過程，與心肌病和心血管損傷等心血管疾病的發(fā)生密切相關(guān)［28］。JUN是一種原癌基因蛋白，參與心肌的缺血再灌注損傷及細(xì)胞的凋亡［29］，研究表明核轉(zhuǎn)錄因子C-JUN活化可能參與了動(dòng)脈粥樣硬化中MMP9表達(dá)的調(diào)控［30］。

3.2 丹參水溶性成分治療CHD的機(jī)制探討

GO生物功能顯示，共有3 230個(gè)生物過程條目，涉及白細(xì)胞遷移、積極調(diào)控細(xì)胞遷移、對(duì)受傷的反應(yīng)、對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)等；327個(gè)細(xì)胞組成條目，涉及膜筏、膜面、細(xì)胞外基質(zhì)等；406個(gè)分子功能條目，涉及內(nèi)肽酶活性、激酶結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合等。KEGG信號(hào)通路發(fā)現(xiàn)，內(nèi)分泌抵抗、流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)、腎素-血管緊張素系統(tǒng)等通路參與調(diào)控。其中，肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)信號(hào)通路是主動(dòng)脈夾層發(fā)生和發(fā)展的原因所在［31］。David N等［32］提出動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病學(xué)的低振蕩剪切應(yīng)力學(xué)說，認(rèn)為血流剪切應(yīng)力異常是發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化病變的主要原因。已有研究發(fā)現(xiàn)，丹酚酸B通過降低MMP9的蛋白表達(dá)可抑制冠狀動(dòng)脈粥樣硬化信號(hào)通路［33］，從而減輕動(dòng)脈粥樣硬化病變并穩(wěn)定斑塊。腎素-血管緊張素系統(tǒng)的各種活性代謝產(chǎn)物通過與其受體結(jié)合，可激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)而發(fā)揮多種生理與病理作用。如Ang II激活ERK、MAPK、Rho A／Rho等激酶通路而增加心肌成纖維細(xì)胞增殖和膠原的合成，引起心肌纖維化［34］。由此推測，丹參水溶性成分可能通過肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)相關(guān)的EGFR、F2、ITGA2B、ITGB1、PIK3CA、MAPK1、SRC的靶點(diǎn)；流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化通路的相關(guān)靶點(diǎn)HSP90AA1、ITGA2B、JUN、MMP2、MMP9、NFE2L2、PIK3CA、MAPK8、SELE、SRC；腎素-血管緊張素系統(tǒng)通路的相關(guān)靶點(diǎn)AGTR1、ACE、MME綜合發(fā)揮抗CHD的作用。

綜上所述，丹參活血祛瘀之功效在東漢時(shí)期《神農(nóng)本草經(jīng)》中就已體現(xiàn)。本課題組在前人研究的基礎(chǔ)上，從丹參的水溶性酚酸類成分出發(fā)，運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法探究治療CHD的作用機(jī)制與物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究雖然能與以往的相關(guān)研究互相驗(yàn)證，但還存在很大的發(fā)掘空間。如表2中Degree值較高的成分丹酚酸F和丹酚酸G，鮮有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，可為以后的研究提供理論依據(jù)。本文僅在理論水平上初步探究，因此還需加以驗(yàn)證。中藥發(fā)揮療效必定是多成分、多靶點(diǎn)的協(xié)同作用，因丹參是由水溶性成分與脂溶性成分混合而成的產(chǎn)物，所以不排除脂溶性成分對(duì)血液流變也有影響。相信在不久的將來，隨著社會(huì)的發(fā)展，技術(shù)的進(jìn)步，能夠揭示出更多的科學(xué)內(nèi)涵。