經支氣管鏡防污染采樣刷檢在兒童難治性肺炎病原學診斷中的價值

吳振波，蔡志明，黃寶瑤，孟雪，陳泳言，李秋波，陳卓杰，張麗霞，鄧籌芬

（江門市婦幼保健院1.兒科；2.檢驗科，廣東 江門529000）

肺炎是兒童最常見的疾病之一，也是目前全球5歲以下兒童死亡的主要原因之一[1]。近年來，隨著兒童社區獲得性肺炎（community acquire pneumonia，CAP）診療的不斷規范，我國兒童CAP診療水平有了明顯進步，經系統規范治療的大部分CAP均可治愈，但仍有部分病情不能控制，甚至進展為難治性肺炎（refractory pneumonia，RP）[2]。RP具有起病急、進展快、病情重、常規治療效果差、并發癥多和死亡率高的特點，臨床治療十分棘手，如何盡早獲得準確的病原體信息、并使用有效的抗菌藥物是治療的關鍵[3-5]。

本研究將經支氣管鏡防污染采樣刷檢培養與傳統的痰培養和支氣管肺泡灌洗（bronchoalveolar lavage，BAL）培養進行比較分析，以尋找有效的兒童RP 病原學診斷采樣方法，從而提高病原學診斷的準確性和敏感性，為臨床抗菌藥物的使用提供參考依據。

1 資料和方法

1.1 一般資料

回顧性分析2019年9月－2020年5月90例于本院兒內科住院的RP 患兒的臨床資料。其中，男52例，女38 例；年齡0～14 歲，嬰幼兒（0～3 歲）58例，學齡前兒童（3～6歲）21例，學齡期兒童（＞6歲）11例。納入標準：血清降鈣素原（procalcitonin，PCT）、C反應蛋白（c-reaction protein，CRP）、白細胞計數（white blood cell，WBC）和/或中性粒細胞百分比等感染指標升高，結合臨床考慮存在細菌感染；同時符合以下至少1 項標準[6]：①病程在3 周以上，且療效不佳；②常規治療1周后，癥狀、體征、X線胸片或胸部CT 等均無明顯好轉跡象；③病程在1 周以內，但X 線胸片或胸部CT 有明顯實變或不張。所有患者均排除先天性支氣管、血管畸形和呼吸系統腫瘤等疾病。所有患兒均符合可彎曲支氣管鏡檢查指征[7]，家屬于術前簽署知情同意書。

1.2 方法

90 例患兒均在住院期間先后進行痰培養、BAL取材和經支氣管鏡防污染采樣刷檢取材。

1.2.1 設備與耗材①Olympus 公司生產的EVIS LUCERA BF-260系列支氣管鏡（型號：BF-XP260F，外徑2.8 mm，工作孔道為1.2 mm），Seesheen 公司生產的QG 系列電子支氣管鏡（型號：QG 3320，外徑3.1 mm，工作孔道為1.2 mm）；②杭州富陽精銳醫療科技有限公司生產的單套管一次性使用毛刷（刷頭構造為尼龍刷，外套單層塑料管，有效長度1 200 mm，適用內鏡通道≥1.2 mm），毛刷先端開口用相對分子質量為4 000 的聚乙二醇滅菌后封堵、栓塞；③一次性吸痰管、一次性痰液收集器、吸痰器。

1.2.2 完善術前準備根據《中國兒科可彎曲支氣管鏡術指南（2018年版）》[7]，完善以下術前準備：①輸血前檢查；②出、凝血時間；③心肝腎功能；④心電圖；⑤患兒監護人簽署支氣管鏡診療知情同意書；⑥根據胸部CT 等影像學資料充分評估肺部情況，擬定刷檢及灌洗的取材部位；⑦做好術前禁食。

1.2.3 取材方法①痰培養：使用一次性吸痰器，在無菌操作下負壓抽取咽喉部分泌物至痰液收集器，常溫下立即送檢；②經支氣管鏡防污染采樣刷檢：患兒局麻，操作者常規使用支氣管鏡檢查；從一側鼻孔進鏡（一般為右側），檢查順序為先健側后患側，到達病變部位后，對局部病變進行觀察，再固定內鏡于擬取材位置，助手持聚乙二醇封堵后的單套管毛刷經支氣管鏡工作孔道進入，毛刷伸出內鏡先端后，緩慢送入取材部位，直至遇到阻力不能繼續深入時，再回退1.0～2.0 cm，通過毛刷手柄推出毛刷，過程中其前端的聚乙二醇保護塞將被頂掉，然后用手柄操控毛刷反復伸縮3次，縮回毛刷至套管內，再從支氣管鏡工作孔道中退出，將毛刷刷頭部分伸出并置入葡萄糖腦心浸液肉湯管中，充分震蕩，使標本與毛刷脫離，取出毛刷，無菌密封肉湯試管，常溫下立即送檢；③BAL[7]：完成毛刷取材后，局麻下用支氣管鏡對取材后的病變部位進行灌洗，以37℃無菌生理鹽水注入[1 mL/（kg·次）]，同時評估該肺段回流和通氣情況，然后以100～200 mmHg （1 mmHg=0.133 kPa）的負壓將液體回收至一次性無菌痰液收集器中，常溫下立即送檢。

1.2.4 標本處理①痰培養：標本在無菌條件下四分區劃線法分別接種至血平板、巧克力平板和沙保氏平板；②經支氣管鏡防污染采樣刷檢物培養：將含標本的葡萄糖腦心浸液肉湯培養管置于37℃普通恒溫孵育箱，待24 h后，用無菌四分區劃線法分別接種至血平板、巧克力平板和沙保氏平板；③BAL培養：離心灌洗液，去上清，混勻沉淀，無菌四分區劃線法分別接種至血平板、巧克力平板及沙保氏平板。

1.2.5 細菌鑒定3 種標本完成上述步驟后，均置于37℃的5% CO2恒溫培養箱培養24 h 后，用VITEK MS 質譜儀進行細菌鑒定，VITEK 2 COMPACT細菌鑒定藥敏儀結合紙片法進行藥敏試驗[8-11]。用校正的接種環換轉成閾值，分離菌陽性截斷點設定：經支氣管鏡防污染采樣刷檢物培養≥103CFU/mL；BAL培養≥104CFU/mL；痰培養分離出致病菌或條件致病菌，若菌落數≥106CFU/mL，則認定為病原菌，若菌落數達不到上述指標或培養出的菌株與臨床表現不相符，又不能排除污染可能，則予以重復送檢，如兩次送檢均培養出菌落數接近的相同菌株，也認定為病原菌。但在某些情況下，如：疾病早期在病原體采樣前使用過抗菌素，有可能影響到培養的結果，會出現假陰性。

1.3 臨床療效判定標準

參照《抗菌藥物臨床研究技術指導原則（2015版）》[12]，制定評判標準：①痊愈或顯效：癥狀、體征均完全或明顯消失，如肺部啰音、咳嗽、咳痰和氣促等癥狀明顯減輕或消失，體溫正常，呼吸音強度恢復正常，復查血小板壓積（plateletcrit，PCT）、CRP和（或）WBC等感染指標恢復正常，X線檢查滲出影完全或明顯吸收，肺不張復張；②有效：癥狀、體征均好轉，肺部啰音、咳嗽、咳痰和氣促等癥狀減輕，體溫正常，呼吸音強度增強，復查PCT、CRP 和（或）WBC 等感染指標好轉，X 線檢查滲出影較前吸收好轉，肺不張減輕；③無效：癥狀、體征無改善甚至惡化，復查PCT、CRP和（或）WBC等感染指標無改變或加重，X線檢查滲出影及肺不張加重。

1.4 統計學方法

選用SPSS 20.0 軟件進行統計分析，計數資料用例（%）表示，行χ2檢驗，P＜0.01 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3種取材方法致病菌培養陽性率比較

90 例標本培養，經支氣管鏡防污染采樣刷檢、BAL、痰培養3種取材方法的細菌培養總陽性率分別為60.0%（54/90）、32.2%（29/90）和14.4%（13/90），3組比較，差異有統計學意義（χ2=41.41，P＜0.01）。痰培養陽性率與BAL 比較，差異有統計學意義（P＜0.01），經支氣管鏡防污染采樣刷檢陽性率與痰培養和BAL 陽性率比較，差異均有統計學意義（P＜0.01）。見表1～4。

表1 3種取材方法致病菌培養陽性率比較 例（%）Table 1 Comparison of the positive rate of pathogenic bacteria culture among the three sampling methods n（%）

2.2 經支氣管鏡防污染采樣刷檢的不同年齡組患兒病原學情況

嬰幼兒組58 例，細菌培養陽性39 株，前三位病原菌分別為金黃色葡萄球菌、緩癥鏈球菌和肺炎鏈球菌。學齡前兒童組21例，細菌培養陽性9株，前三位病原菌分別為肺炎鏈球菌、糞腸球菌和銅綠假單胞菌。學齡期兒童組11例，細菌培養陽性6株，前三位病原菌為大腸埃希氏菌、流感嗜血桿菌和肺炎鏈球菌。

2.3 臨床療效

經支氣管鏡防污染采樣刷檢取樣、細菌定量培養陽性的所有病例，都遵照經支氣管鏡防污染采樣刷檢培養及藥敏結果選擇敏感抗菌藥物進行抗感染治療，總有效率為100.0%。其中痊愈或顯效占92.2%（83/90）；有效6.7%（6/90），6例患兒全部發熱消退，咳嗽、氣促減輕，肺部啰音減少，具體情況如下：3例復查感染指標及影像學較前好轉，2 例自動出院，未予以復查感染指標及影像學，1例肺膿腫患兒入院時病情嚴重，已錯過最佳抗感染時機，雖然根據病原學結果積極抗感染治療，臨床癥狀逐漸好轉，但是仍發生了嚴重的氣胸、包裹性胸腔積液及纖維板形成，后轉胸外科治療。

表2 經支氣管鏡防污染采樣刷檢細菌培養陽性結果 例Table 2 Positive results of bacterial culture by bronchoscope anti contamination sampling brush n

表3 BAL法細菌培養陽性結果 例Table 3 Positive results of bacterial culture by BAL n

表4 痰培養法細菌培養陽性結果 例Table 4 Positive results of bacterial culture by sputum culture n

2.4 3種采樣方法不良反應和并發癥

2.4.1 痰培養本組患兒全部存在惡心和干嘔，不良反應發生率為100.0%（90/90）；咳嗽發生率為94.4%（85/90）；黏膜出血發生率為36.7%（33/90）。

2.4.2 BAL低氧血癥發生率42.2%（38/90），支氣管痙攣和喉痙攣發生率31.1%（28/90），發熱發生率12.2%（11/90），出血發生率7.8%（7/90）。絕大多數患兒癥狀輕微，并發癥發生時暫停操作、加大給氧濃度和加強麻醉鎮靜后都可緩解。

2.4.3 經支氣管鏡防污染采樣刷檢黏膜出血發生率為81.1%（73/90），多發生于小嬰兒（＜6 個月）。1例患兒發生氣胸，發生率為1.1%（1/90），該患兒在刷檢后第2天查胸片，發現氣胸，但肺壓縮體積不大，臨床癥狀輕微，無呼吸困難及發紺，未予穿刺抽氣，予吸氧監護觀察5 d后復查胸片完全吸收。

3 討論

RP 的診治中，病原學的準確判斷及敏感抗菌藥物的正確選擇是診治關鍵。采集患者下呼吸道感染標本的方法有咳/吸痰法、經皮肺穿刺吸引、局限性開胸肺活檢、氣管內吸引、經支氣管鏡肺活檢和BAL等[13]。由于上呼吸道正常定植菌可達200多種，常規痰培養因陽性率低或污染嚴重，病原菌與污染菌不易區分，臨床參考價值不大[14]。經皮肺穿刺和開胸肺活檢是診斷肺部疾患的金標準，可用于組織病理學檢查、病原學檢查和培養，確診率較高，但由于其創傷大、風險高、費用高和并發癥相對較多，難以作為常規檢查方法在臨床推廣使用[15]。

近年來，支氣管鏡在兒童呼吸系統疾病中已廣泛應用。大量研究[16-18]表明，BAL 明顯提高了兒童RP病原體診斷的陽性率及準確率，但操作時支氣管鏡需經鼻腔、口腔和咽喉部到達下呼吸道，在缺乏防污染保護措施下，容易將上呼吸道的定植菌帶至下呼吸道，造成標本污染，直接影響培養結果的可靠性。RP 患兒炎性分泌物往往多而黏稠，容易栓塞細小的遠端支氣管，外徑4.0 mm 甚至2.8 mm 的支氣管鏡常難以進入到深部病灶，加上肺泡通氣、回流障礙和灌洗面積及負壓吸力不足等，導致單純的BAL 有時難以獲得足夠量的病原體標本，影響了BAL 培養陽性率。

本研究采用單套管一次性使用毛刷，用無菌聚乙二醇封堵先端，通過影像學定位及超細支氣管鏡輔助進入病變最重的部位進行病原學取材。該取材方法具有以下優勢：①毛刷能輕易進入支氣管鏡不能到達的病灶根源，從而獲得精準而濃度高的病原體標本，提升了培養陽性率；②毛刷通過支氣管鏡工作通道進入下呼吸道，避開了與上呼吸道直接接觸，減少了定植菌的污染，經無菌聚乙二醇封堵先端后，進一步加強了防污染能力，取材的培養結果可靠性高，可以有效地區分致病菌和定植菌[19-20]；③刷檢可以幫助深部痰栓的清除：RP 患兒常存在較重的遠端支氣管分泌物栓塞，尤其在塑型性支氣管炎患兒中多見，常規的灌洗及負壓吸引很難將痰栓取出，但刷檢過程中通過毛刷的進出和轉動，可以將部分痰栓帶出，或先將痰栓松動，再在完成刷檢取材后加大負壓將其吸出。但為保證取材質量及減少并發癥，操作者應注意：①支氣管鏡從上呼吸道進入下呼吸道前禁止負壓吸引，以免吸入上呼吸道的定植菌；②進入下呼吸道后，在完成刷檢前也應盡可能避免負壓吸引，防止支氣管鏡工作孔道被污染，以保證刷檢結果的準確性；③毛刷送入取材部位遇到阻力后，應回退1.0～2.0 cm 再進行刷檢，以降低出血及氣胸的風險；④遇到黏膜上有隆起且表面血運豐富的組織時，應盡量避免刷檢，以免引起大出血；⑤術中做好鎮靜，避免在患兒躁動、劇烈咳嗽時進行刷檢。聚乙二醇無毒性，可在之后的BAL過程中負壓吸引出或融化后自行咳出。

筆者對90例RP患兒進行痰培養、經支氣管鏡防污染采樣刷檢和BAL，3種細菌培養總陽性率分別為14.4%（13/90）、60.0%（54/90）和32.2%（29/90），與國內相關報道[21]基本一致。本研究顯示，經支氣管鏡防污染采樣刷檢陽性結果中，革蘭氏陽性菌占比64.8%（35/54），革蘭氏陰性菌占比35.2%（19/54）；嬰幼兒（0～3 歲）前三位病原菌分別為金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌和緩癥鏈球菌；學齡前患兒（3～6歲）前三位病原菌分別為肺炎鏈球菌、糞腸球菌和銅綠假單胞菌；學齡期患兒（＞6 歲）前三位病原菌分別為大腸埃希氏菌、流感嗜血桿菌和肺炎鏈球菌，與華春珍等[22]報道基本相符。由于3 歲以內（尤其1歲以內）的嬰幼兒正常菌群及黏膜的屏障功能尚未完善，加上二胎政策的開放增加了居家交叉感染的概率，本研究采集病史時發現，此年齡段的患兒發病前，大多有明確的呼吸道感染患者（哥哥/姐姐）密切接觸史，以金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌感染居多，緩癥鏈球菌感染則全部發生在1 歲以內的患兒中，考慮與該年齡患兒體內特異性IgM不足和免疫功能低下有關。3～6 歲的幼兒免疫系統雖有提升，但體內IgG 仍相對不足[23]，且大多為入托兒童，集體生活交叉感染引發的CAP 較為多見，肺炎鏈球菌居病原體首位。本研究中6歲以上患兒最少，可能與該年齡段兒童免疫功能逐步完善、感染及進展為RP 的概率相對較低相關，且病原體以大腸埃希氏菌為主，不排除與季節有關。

綜上所述，RP 的治療在臨床上是棘手問題，盡早獲取可靠的病原學信息對診斷及治療至關重要。本研究所有RP 患兒均先后聯合使用痰培養、經支氣管鏡防污染采樣刷檢及BAL 3 種方法進行病原學取材，采用經無菌聚乙二醇封堵的單套管一次性使用毛刷，在超細外徑的可彎曲支氣管鏡引導下，對深部支氣管進行采樣刷檢取材，標本細菌培養的陽性率和可靠性最高，對兒童RP 病原體的正確診斷和抗生素的合理選擇有很好的指導作用，值得臨床推廣應用。而BAL培養的陽性率和可靠性次之，但BAL操作性更靈活，可以選擇多段多葉進行灌洗，通過反復負壓吸引可以獲得更多的病原體標本量及細胞數，為病原體的診斷提供了寶貴的信息，與經支氣管鏡防污染采樣刷檢聯合使用，具有互補作用，可進一步提高病原體的檢出率。