復(fù)智散對(duì)阿爾茨海默病轉(zhuǎn)基因鼠腦神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)顆粒素通路的影響

宋冬晶 劉 斌 劉新宇 王 曄 王德生 紀(jì) 勇

(哈爾濱市第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001)

神經(jīng)顆粒素(Ng)是特異性神經(jīng)元突觸后膜蛋白，是神經(jīng)可塑性及學(xué)習(xí)記憶調(diào)控過(guò)程中的一個(gè)重要蛋白，其基因表達(dá)和蛋白質(zhì)合成主要分布于海馬、前額皮層、紋狀體和杏仁核〔1〕。作為突觸后蛋白激酶(PK)C的作用底物和Ca2+敏感性鈣調(diào)蛋白(CaM)結(jié)合蛋白，Ng主要通過(guò)調(diào)控Ca2+和CaM依賴性酶包括Ca2+- CaM依賴性蛋白激酶(CaMK)Ⅱ等，參與學(xué)習(xí)記憶過(guò)程〔2～6〕。本文通過(guò)觀察復(fù)智散對(duì)轉(zhuǎn)基因阿爾茨海默病(AD)小鼠腦神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Ng通路的影響，探討復(fù)智散治療AD的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物及分組 6月齡APP/PS1 雙重轉(zhuǎn)基因小鼠，購(gòu)自南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所。正常對(duì)照組為15只相同遺傳背景同月齡的C57BL/6J小鼠。實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為對(duì)照組(蒸餾水23 ml/d)、模型組(蒸餾水23 ml/d)、低劑量組(1.25 g/kg)、中劑量組(2.5 g/kg)、高劑量組(5.0 g/kg)、安理申組(0.54 mg·kg-1·d-1)，各組15只。連續(xù)灌胃21 d。

1.2藥物 復(fù)智散(FZS)，哈醫(yī)大一院王德生教授研發(fā)，由人參、節(jié)菖、蒲黃芩等八味中草藥組方而成。水浸泡40 min，煎煮1 h，過(guò)濾出藥汁。加水煎煮40 min后再次過(guò)濾，將兩次濾過(guò)的藥汁混合，配制成FZS濃度為0.25 g生藥/ml的提取液，于4℃保存。安理申(鹽酸多奈哌齊)，5 mg/片，購(gòu)自衛(wèi)材藥業(yè)。

1.3Western印跡檢測(cè)蛋白表達(dá)量 腦組織剪至約150 mg，加300 μl蛋白質(zhì)抽提液，勻漿。最高速度漩渦振蕩5 s。12 000 r/min，4℃離心5 min。迅速把上清液轉(zhuǎn)移至另外一個(gè)預(yù)冷的離心管，-20℃保存。加樣到96孔板，標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液調(diào)整最終量到20 μl；A570 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)OD配平各組蛋白；1∶4的比例加入SDS-PAGE5倍上樣緩沖液，水煮，直至蛋白質(zhì)變性電泳分析。曝光顯影。

2 結(jié) 果

2.1行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 模型組潛伏期明顯長(zhǎng)于對(duì)照組(P<0.01)；各用藥組潛伏期均有不同程度改善，中劑量組和安理申組的潛伏期明顯短于模型組(P<0.01)，中劑量組與安理申組比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)。模型組小鼠電擊時(shí)間明顯長(zhǎng)于對(duì)照組(P<0.01)；各用藥組的電擊時(shí)間均短于模型組，其中中劑量組、安理申組最明顯(P<0.01)，而中劑量組與安理申組電擊時(shí)間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

2.2小鼠海馬Ng信號(hào)通路表達(dá)水平變化 模型組鼠Ng蛋白表達(dá)量較對(duì)照組顯著降低(P<0.01)。與模型組比較，安理申組、高劑量組、中劑量組、低劑量組Ng 蛋白均有不同程度增高，其中安理申組、中劑量組變化最明顯，與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05 或P<0.01)，中劑量組優(yōu)于安理申組。

對(duì)照組Aβ、APP、BACE 和PS-1蛋白表達(dá)量較低；模型組轉(zhuǎn)基因小鼠腦細(xì)胞內(nèi)APP蛋白表達(dá)量較對(duì)照組APP蛋白表達(dá)量明顯增多，其中Aβ、BACE 和PS-1蛋白表達(dá)增加更顯著(P<0.05或P<0.01)。與模型組比較，安理申組、高劑量組、中劑量組、低劑量組APP的蛋白表達(dá)量均有不同程度降低，其中安理申組、中劑量組變化最明顯(P<0.05或P<0.01)。APP、BACE和PS-1蛋白表達(dá)量安理申組與中劑量組無(wú)顯著差異。復(fù)智散中劑量組Aβ蛋白表達(dá)明顯低于安理申組(P<0.05)。

3 討 論

生理狀態(tài)下，Ng與CaM結(jié)合形成復(fù)合體，當(dāng)神經(jīng)沖動(dòng)引起NMDAR活化，與受體偶聯(lián)的Ca2+通道開(kāi)放，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高，Ng與CaM復(fù)合體解離，游離Ng被PKC磷酸化，與CaM親和力降低，細(xì)胞內(nèi)Ca2+與CaM復(fù)合體濃度增加，激活Ca2+和CaM依賴性酶，如CaM依賴性NO合酶、CaMKⅡ及CaM依賴性腺苷酸環(huán)化酶AC1、AC8等，這些酶均參與LTP的誘導(dǎo)和維持，因此Ng是調(diào)控學(xué)習(xí)和記憶過(guò)程的重要蛋白。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Ng基因敲除的小鼠海馬LTP明顯受損，空間學(xué)習(xí)能力受損，提示了Ng在學(xué)習(xí)記憶過(guò)程中的重要作用〔7～9〕。

實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Ng主要是通過(guò)促進(jìn)依賴于Ca2+的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑提高海馬LTP和學(xué)習(xí)記憶能力〔10〕，即神經(jīng)元內(nèi)Ng濃度越高，Ng-CaM復(fù)合體的形成越多，Ng可被視為神經(jīng)元內(nèi)CaM的儲(chǔ)庫(kù)。因而當(dāng)Ca2+流入細(xì)胞內(nèi)，將有更多的CaM與Ca2+結(jié)合，有利于激活Ca2+與Ca2+-CaM依賴的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，包括PKC、CaMKⅡ。最近，有研究進(jìn)一步證實(shí)Ng作為記憶形成機(jī)制的上游調(diào)控子，通過(guò)調(diào)控游離的Ca2+和CaM，在PKC介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起關(guān)鍵作用。

模型組鼠海馬NMDAR的關(guān)鍵亞基NR1表達(dá)水平降低，這可能是認(rèn)知功能下降的原因之一。AD鼠海馬和前額皮層Ng蛋白表達(dá)水平下降。同時(shí)，Ng信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的兩個(gè)關(guān)鍵酶PKC和CaMK水平也明顯下降。提示AD可能通過(guò)影響中樞重要腦區(qū)中以Ng為上游調(diào)控子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路損害機(jī)體的學(xué)習(xí)記憶功能；FZS可通過(guò)提高Ng通路蛋白表達(dá)而改善AD鼠的認(rèn)知功能。

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