MALAT1通過miR-30調控骨巨細胞瘤基質細胞生長、遷移和侵襲

薛偉 康少英 郭洪生 王培霞 王振興 高慶亮 李巖 張英民 王華軍 鄭小飛

1邯鄲市中心醫院骨三科（河北邯鄲056001）；2暨南大學第一臨床醫學院，暨南大學附屬第一醫院骨關節與運動醫學中心（廣州510630）

骨巨細胞瘤（giant cell tumor of bone，GCTB）是原發骨腫瘤，臨床上較為常見，約占全部骨腫瘤的6%［1］。多見于20～40 歲青年人群，好發于四肢長骨［2］。骨巨細胞瘤具有極強的侵襲能力，產生嚴重的溶骨性骨破壞［3］。溶骨性骨破壞引起嚴重骨痛并可導致病理性骨折，嚴重影響患者生存質量［4］。基質細胞（spindle-like stromal cells of GCTB，GCGSC）被認為是骨巨細胞瘤中唯一具有無限增殖能力的腫瘤成分細胞，在溶骨性骨破壞和腫瘤異常增殖過程中起關鍵作用［5］。長鏈非編碼RNA（LncRNA）不僅在多種腫瘤中發揮重要作用［6］，而且對骨生長、分化等功能也有調節作用［7］。研究表明LncRNA MALAT1 通過多種信號通路調節骨肉瘤發生發展［8-11］，可能是骨肉瘤的治療靶點之一［12］。然而MALAT1 對于骨巨細胞瘤的調控作用未知。另一方面，MALAT1 作為miRNA（微小核糖核酸）海綿（microRNA sponge），競爭miRNAs 結合區域，使得miRNA 無法與下游靶基因結合，從而抑制miRNA 的功能，影響蛋白質編碼轉錄［13］。因此，闡明MALAT1 對骨巨細胞瘤的作用，明確其海綿的靶miRNA，可以為臨床治療骨巨細胞瘤提供理論基礎和治療靶點，具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 標本來源選取2017年1月到2019年6月在邯鄲市中心醫院就診的3 例骨巨細胞瘤患者術后樣本，均經病理切片確診，并取同一患者未有腫瘤侵襲的松質骨組織（癌旁組織）作為對照樣本。取樣符合本單位的倫理學標準并得到了批準，且取樣獲得患者或家屬的知情同意。

1.2 體外培養原代骨巨細胞瘤細胞系取骨巨細胞瘤腫瘤組織，PBS 沖洗后剪碎，置于含20%胎牛血清的高糖DMEM 培養基，置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養。24 h 后半量換液，觀察細胞生長狀況。細胞經過8 次傳代后可獲得純度較大的基質細胞［14］，凍存一批備用（Stromal cells，圖1）。建系成功后的骨巨細胞瘤細胞培養于96 孔板，6 孔板進行相應轉染實驗。

圖1 體外培養的骨巨細胞瘤基質細胞典型形態（200×）Fig.1 Presentative images of cultured stromal cells of giant cell tumor of bone（200×）

1.3 MTT 檢測細胞增殖復蘇培養骨巨細胞瘤基質細胞以5 × 105∕mL 的密度接種于96 孔板。細胞轉染后，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養48 h，培養結束后每孔添加20 μL 的MTT∕PMS 混合液（購于碧云天公司），按試劑盒說明書進行相應處理，再次培養2 h，最后用酶標儀在490 nm波長下對樣本進行定量檢測。計算細胞增殖生長速度。

1.4 qPCR 檢測lncRNA 及miRNA 水平骨巨細胞瘤組織或細胞于液氮下研磨，加入TRIZOL（購自Invitrogen）裂解細胞，按常規步驟提取總RNA。逆轉錄試劑盒購自TAKARA 公司（日本），按照試劑盒操作程序進行逆轉錄，-80 ℃保存備用。為檢測lncRNA MALAT1 及miR-30 表達水平，參照文獻合成對應的探針引物進行實時定量PCR 反應（ABI Taqman lnc∕miRNA RT 試劑盒）。反應體系：初始95 ℃10 min；95 ℃30 s，解鏈；58 ℃30 s 退火；70 ℃10 s 延伸，設置30 個循環；70 ℃10 min后-80 ℃保存。以內參為對照，取三復孔進行平均，對照組設為100%，對實驗組進行相對定量。

1.5 熒光素酶報道基因設計引物擴增lncRNA MALAT1 的3′UTR 區序列，將其克隆到PGL3 basic載體，構建PGL3-MALAT1-WT 質粒；設計相應的MALAT1 突變 質粒，構建PGL3-MALAT1-MUT 質粒。GenePharm 吉瑪公司合成miR-30 的mimic 及inhibitor 片段，在293 細胞轉染相應的質粒及miR-30 片段。48 h 后裂解細胞，檢測熒光素酶活性。

1.6 細胞轉染與Transwell細胞遷移和侵襲基質細胞細胞融合至50%，采用Lipofectamine 2000 試劑盒 轉 染MALAT1 質 粒 和∕或miR-30 mimic∕inhibitor片段（由GenePharm 吉瑪公司合成）。細胞轉染后，收集各組處理細胞，用100 μL 無血清重懸轉入Transwell 小室，進行遷移和侵襲（鋪Matrigel 膠），在37 ℃，5% CO2的細胞培養箱孵育24 h 后取出小室，4%多聚甲醛固定20 min，PBS 洗滌1 次，結晶紫染色10 min，PBS 洗干凈，并于顯微鏡下觀察細胞是否穿透小孔，并進行拍照，200×光鏡選取5 個視野計數穿膜細胞個數，實驗重復3 次。

1.7 統計學方法應用SPSS 20.0 統計軟件進行分析，計量資料采用均數±標準差組間比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MALAT1 及miR-30 在骨巨細胞瘤組織中的表達情況通過實時定量qPCR 技術，對臨床收集的3 例骨巨細胞瘤組織及松質骨對照組織進行MALAT1 及miR-30 表達水平的檢測。結果表明，與對照組相比，miR-30在骨巨細胞瘤組織中的表達水平顯著升高［（1.032±0.064）vs.（2.135±0.240），P＜0.05］，而MALAT1 的水平則顯著減低［（1.086±0.119）vs.（0.630±0.100），P＜0.05］。見圖2。

圖2 實時定量PCR 檢測骨巨細胞瘤組織中miR-30 及MALAT1 表達情況Fig.2 The levels of miR-30 and MALAT1 in GCTB tissues were detected by quantitative PCR

2.2 熒光素酶報道基因檢測MALAT1 靶向吸附miR-30 的情況生物信息學工具ENCORI 分析發現，MALAT1 的chr11：65267543-65267564 區域有miR-30的結合位點，提示MALAT1可能是miR-30的靶基因。構建包含miR-30 靶向的MALAT1 3′UTR區域的熒光素酶報道基因（MALAT1 WT）及相應的突變（MALAT1 MUT）質粒，合成miR-30 mimic 相似物。見圖3A。

熒光素酶報道基因實驗的結果表明，過表達MALALT1 WT 和miR-30 片段后，熒光素酶報道的熒光信號明顯減弱［（1.012 ± 0.126）vs.（0.479 ±0.062），P＜0.05］。過表達miR-30 mimic 相似物對突變質粒的熒光信號不產生影響。結果說明miR-30 及MALAT1 有直接調控關系。見圖3B。

圖3 MALAT1 表達對miR-30 的影響Fig.3 The influence of MALAT1 expression on miR-30

2.3 MALAT1、miR-30單獨對骨巨細胞瘤基質細胞生長及遷移侵襲的調控通過MTT實驗及Transwell實驗觀察過表達MALAT1 及抑制miR-30 對細胞的生長、遷移和侵襲的影響。過表達MALAT1之后，基質細胞生長明顯被抑制，其生長曲線變得平緩；而且Transwell 的實驗結果表明，過表達MALAT1 后，細胞的遷移和侵襲能力顯著下降（P＜0.05）。見圖4A-C。過表達miR-30 inhibitor抑制物之后，基質細胞的生長（圖4D）、遷移（P＜0.05，圖4E）和侵襲（P＜0.05，圖4F）能力也同樣受到抑制。

圖4 MALAT1、miR-30 對骨巨細胞瘤基質細胞生長、遷移和侵襲的影響Fig.4 The role of MALAT1 and miR-30 on the growth，migration and invasion of stromal cells

2.4 MALAT1 通過miR-30 對骨巨細胞瘤基質細胞生長及遷移侵襲的調控上下游拮抗實驗結果見圖5。過表達miR-30 mimic 類似物可顯著促進細胞的生長，而如果同時過表達MALAT1 則可以抵消miR-30 mimic 類似物的促進作用（圖5A）；同樣的，過表達miR-30 mimic 類似物會促進細胞的遷移和侵襲，而同時過表達MALAT1 則可抑制miR-30 mimic 類似物的促進作用（圖5B-E）。

圖5 MALAT1 通過miR-30 發揮調控骨巨細胞瘤基質細胞生長、遷移和侵襲的作用Fig.5 MALAT1 regulate miR-30 to affect the growth，migration and invasion of stromal cells

3 討論

骨巨細胞瘤是一種局部侵襲性溶骨性腫瘤，可引起嚴重的骨破壞［15］。骨巨細胞瘤一般為良性腫瘤，但具有惡變成為惡性的骨巨細胞瘤的傾向［16］。外科手術治療后，27%～65%的骨巨細胞瘤患者表現出局部復發［17］，并且高達6%的骨巨細胞瘤發生肺轉移［18-19］。眾多的文獻主要集中在探討骨巨細胞瘤發生的原因及危險因素，而對具體的生理病理機制缺乏深入了解。基質細胞是骨巨細胞瘤遷移和侵襲的主要細胞成分，研究調控基質細胞分化、遷移和侵襲的機制，有助于為臨床治療骨巨細胞瘤提供新的思路和理論依據。本研究發現長鏈非編碼RNA MALAT1 在骨巨細胞瘤組織中低表達而微小RNA miR-30 則高表達，而進一步通過生物信息學分析發現MALAT1 存在吸附抑制miR-30的靶向序列，且通過熒光素酶報道基因及突變實驗證明了MALAT1 可靶向調控miR-30；單獨過表達MALAT1 或者抑制miR-30 均可抑制骨巨細胞瘤基質細胞生長遷移和侵襲；而且MALAT1 是通過miR-30 調控骨巨細胞瘤發展發揮作用。因此，MALAT1∕miR-30 信號通路是介導骨巨細胞瘤基質細胞生長的關鍵通路。

骨巨細胞瘤是骨破壞腫瘤，因此抑制骨吸收是降低骨巨細胞瘤復發的有效治療策略［20］。研究表明，雙膦酸鹽具有抗骨溶解的保護作用，可廣泛用于骨巨細胞瘤的臨床治療中［21-22］。然而，長期服用雙膦酸鹽可能導致長骨骨骼壞死和非典型性骨折［23］。地諾單抗（Denosumab）是一種針對RANKL的單克隆抗體，最近已被批準用于骨轉移治療，對雙膦酸鹽難治性惡性高鈣血癥和某些巨細胞瘤發揮作用［24-25］。地諾單抗由于其抗吸收作用，骨轉換標志立即下降，但骨堿性磷酸酶注射后1 個月才下降［26-27］。因此，RANK∕RANKL 及其下游分子的受體激活劑的治療途徑可能代表治療骨巨細胞瘤的靶點。RunX2 在多種腫瘤中被報道與RANK∕RANKL信號密切相關［28-29］，且RANK∕RANKL∕RunX2 信號通路與成骨破骨細胞的功能調節密切相關［30-31］。有文獻報道，miR-30a 可以通過與其3′-UTR 結合來調節RunX2 的表達，從而調節破骨細胞的分化并促進骨巨細胞瘤中的骨生成［32］。本研究結果顯示，miR-30 參與調控骨巨細胞瘤，而且MALAT1 可直接靶向調控miR-30。

LncRNA 屬于長鏈非編碼RNA，有很強的組織和細胞特異性，與多種疾病特別是骨科疾病，如骨關節炎、骨肉瘤等疾病的發生發展密切相關［7］。LncRNA 可通過相互作用位點與下游靶miRNA 競爭性相互作用，成為miRNA 的“分子海綿”，吸附性抑制miRNA 使其不能發揮作用。MALAT1 與骨科疾病的關系密切相關，有報道MALAT1 通過靶向人骨髓來源的間充質干細胞中的miRNA-143 來促進osterix 表達以調節成骨分化［33］。MALAT1 可調節肺癌的骨轉移［34］。MALAT1 上調的ZEB-1 可被β-catenin 協調，增強HGF 介導的骨髓間充質干細胞向肝細胞分化的端粒酶活性［35］。骨巨細胞瘤可惡化為骨肉瘤，MALAT1 可調控骨肉瘤細胞的發生發展［36］。本研究結果表明，MALAT1 在骨巨細胞瘤中下調，低表達的MALAT1 不能很好的靶向吸附性抑制miR-30，從而使得骨巨細胞瘤基質細胞生長。

miRNA 被報道參與骨巨細胞瘤發生發展的多個環節的調控［37］。據報道，miR-126-5p 在骨巨細胞瘤的紡錘狀基質細胞中顯著下調，并通過抑制基質金屬蛋白酶13（MMP-13）的表達影響破骨細胞的分化和骨吸收［38］。最近的一項研究還表明，miRNA-106b 通過靶向骨巨細胞瘤中的RANKL 來抑制破骨細胞生成和骨溶解［21］。miRNA 可能會調節破骨細胞的產生和功能［39］。而miR-16-5p 抑制了BMM 中的破骨細胞生成［40］。本研究表明，miR-30 參與了骨巨細胞瘤基質細胞的分化，因此是調控骨巨細胞瘤轉移的關鍵因素。這為miR-30作為靶點提供了深入的證據。骨巨細胞瘤發生發展過程中，除了miR-30 外，肯定還有其他miRNA的參與，且除了RunX2 的下游基因外，其他基因的參與也需要進一步明確。所以本研究也有一定的局限性，大范圍多樣本的高通量測序研究可進一步揭示非編碼及微小RNA 在骨巨細胞瘤中的作用；其下游底物也需要進一步明確，比如是否通過RunX2 發揮作用；而動物實驗也需要進一步驗證MALAT1∕miR-30 通路是否可調節骨巨細胞瘤的肺轉移。

總之，本研究表明LncRNA MALAT1 及miR-30在骨巨細胞瘤中表達水平有異常，MALAT1 可直接海綿吸附抑制miR-30 從而調節骨巨細胞瘤基質細胞的生長、遷移和侵襲。