含炔基官能團(tuán)的咪唑鹽類聚離子液體抗菌劑的制備與表征*

生程鉅，聞林林，周超，鄧林紅△

(1.常州大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，常州 213164；2.常州大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程與健康科學(xué)研究院，常州 213164)

1 引 言

自然環(huán)境中存在大量的細(xì)菌和有害微生物，如果人體表面受傷后，傷口未得到及時(shí)處理，受到細(xì)菌感染，就會(huì)導(dǎo)致一系列的炎癥反應(yīng)，影響傷口愈合，甚至危及生命安全。尤其是糖尿病患者的傷口，由于周圍皮膚毛細(xì)血管阻塞，傷口愈合周期較長(zhǎng)，更易受到細(xì)菌感染。對(duì)于這些長(zhǎng)期難以愈合的傷口，傳統(tǒng)的抗菌敷料很難達(dá)到理想的抗菌效果[1-2]，這是由于其采用的抗菌劑(如金屬離子，抗生素等)存在細(xì)胞毒性或耐藥性等問題[3]。

近年來(lái)，咪唑鹽類聚離子液體作為聚合物抗菌劑顯示了較強(qiáng)的廣譜抗菌性能和較低的生物毒性等優(yōu)點(diǎn)[4-6]。聚離子液體利用其表面富集的陽(yáng)離子基團(tuán)，與細(xì)菌細(xì)胞壁所帶的負(fù)電荷通過靜電作用吸附在細(xì)菌表面，抗菌劑的疏水鏈端刺入細(xì)胞壁，導(dǎo)致細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破裂，使細(xì)菌裂解消亡。各種咪唑鹽類聚離子液體已被證明可以有效殺死大腸桿菌、金黃色葡萄球菌，甚至可以殺死耐藥細(xì)菌，如耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(MRSA)[7-11]。但是，它們中的大多數(shù)仍采用鹵素(氯化物，溴化物，碘化物)或重金屬(鋅，銅)作為絡(luò)合劑，這些成分可能會(huì)在體內(nèi)生物富集并危害正常細(xì)胞，不利于作為長(zhǎng)期使用的輔料抗菌劑[12-13]。

因此，本研究采用毒性更低的炔基作為陰離子絡(luò)合劑，通過縮聚反應(yīng)合成不同主鏈結(jié)構(gòu)的含炔基咪唑鹽類聚離子液體。實(shí)驗(yàn)表明，以該方法制得的抗菌劑，不僅具有高效的抗菌性能，還具有較低的細(xì)胞毒性和較好的生物相容性，可用于臨床醫(yī)用抗菌敷料中。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 材料與主要試劑

2.1.1材料與主要試劑 1,4-二溴丁烷(1,4-dibromobutane)，99%，阿拉丁生化科技股份有限公司，中國(guó)上海。1,2-雙(2-溴乙氧基)乙烷(1,2-Bis(2-bromoethoxy)ethane),99%，T&W GROUP，中國(guó)。丙炔酸鈉(Propiolic Acid Sodium Salt),99%，百靈威科技有限公司，中國(guó)。MH和LB培養(yǎng)基，索萊寶公司，美國(guó)。磷酸鹽緩沖溶液(PBS)、活-死細(xì)菌染色試劑盒、Cell Counting Kit-8(CCK8)試劑盒，碧云天生物技術(shù)有限公司，中國(guó)。胰蛋白胨、特殊的DMEM高糖、胰蛋白酶，Thermo Fisher Scientific，美國(guó)。酵母粉和瓊脂粉，潤(rùn)捷化學(xué)試劑有限公司，中國(guó)。透析袋，MWCO=1000 Da，光譜醫(yī)學(xué)，美國(guó)。甲醛(CH2O，分析純)，乙二醛(C2H2O2,40%，化學(xué)純)，鹽酸(HCl,37%), 濃硫酸(H2SO4,98%), 無(wú)水乙醇(C2H5OH)，氯化鈉(NaCl)，氯化鉀(KCl)，氫氧化鈉(NaOH)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，中國(guó)。

2.1.2實(shí)驗(yàn)儀器 冷凍干燥機(jī)，2.5 L，德國(guó)Freezone公司。pH計(jì)，PB-10，德國(guó)Sartorius公司。倒置式顯微鏡，Primo Vert，德國(guó)Carl Zeiss公司。超凈工作臺(tái)，VS-1300L-U，美國(guó)AIRTECH公司。核磁共振波普儀，AVANCEⅡ500M，德國(guó)布魯克。傅里葉紅外光譜儀，Nicolet A vatar 370, 美國(guó)Thermo Fisher。熒光顯微鏡，AMF4300, 美國(guó)Thermo Fisher。激光粒度儀，ZEN 3600，英國(guó)Malvern公司。

2.2 聚丁基咪唑丙炔酸鹽聚離子液體(PIMB)的和聚二氧雜辛烷咪唑丙炔酸鹽聚離子液體(PIME)的合成

首先，根據(jù)先前公開的方法[14]制備兩種不同分子量大小的典型的咪唑鎓聚合物：聚(N-丁基咪唑鎓溴化物)，聚(N-(3,6-二氧雜辛烷)咪唑鎓溴化物；其次，將丙炔酸鈉與1,4-二溴丁烷或1,2-雙(2-溴乙氧基)乙烷以摩爾質(zhì)量比3：1混合，并與上述咪唑鎓溴化物發(fā)生離子交換，反應(yīng)方程式見圖1；最后，使用透析袋(MWCO=1000 Da)將混合物用水透析24 h，以除去過量的丙炔酸鈉。

圖1 PIMB和PIME的合成Fig.1 Synthesis of PIMB and PIME

2.3 含炔基咪唑鹽類聚離子液體化學(xué)結(jié)構(gòu)表征

以D2O為溶劑對(duì)PIMB和PIME進(jìn)行紅外光譜(FT-IR)表征和核磁共振(1HNMR)表征;PIMB和PIME的電位和粒徑由ZEN3600激光粒度儀測(cè)定(0.5 mg/mL)。

2.4 含炔基咪唑鹽類聚離子液體的抗菌性能測(cè)試

首先，在96孔板的每孔中加入三蒸水100 μL；其次，在第1行分別加入500 μg/mL的PIMB和PIME溶液，采用2倍稀釋法依次稀釋至下一行；接著，向每孔加入100 μL大腸桿菌懸液或金黃色葡萄球菌懸液，混勻后，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，并用無(wú)PIMB和PIME組做為對(duì)照；最后，使用酶標(biāo)儀測(cè)量600 nm處的OD值，同時(shí)用細(xì)菌活死染色試劑盒對(duì)其進(jìn)行染色，以綠光標(biāo)記活細(xì)菌，紅光標(biāo)記死細(xì)菌。PIMB和PIME的MIC值是指抑制90%的大腸桿菌的最小濃度。殺菌率的計(jì)算見式(1)：

(1)

2.5 含炔基咪唑鹽類聚離子液體的細(xì)胞毒性測(cè)試

首先，將聚合物樣品(PIMB和PIME)用PBS緩沖液進(jìn)行溶解，分別配成13.5 mg/mL的溶液；其次，在96孔板上將100 μL聚合物樣品溶液和100 μL成纖維細(xì)胞懸浮液(5×104cells/mL)混合，以100 μL的1X PBS為空白對(duì)照；接著，在5%CO2氣氛中于37℃孵育48 h，然后向孔中加入10 μLCCK-8溶液并孵育1 h；最后，使用酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm處的OD值。同時(shí)用羅丹明和DAPI對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，通過觀察細(xì)胞的形態(tài)來(lái)判斷細(xì)胞的毒性。細(xì)胞存活率的計(jì)算見式(2)：

(2)

3 結(jié)果與討論

3.1 含炔基咪唑鹽類聚離子液體的化學(xué)結(jié)構(gòu)表征

由圖2(a)可知，PIMB和PIME的紅外譜圖在2 200 cm-1處均出現(xiàn)炔基的特征峰，在1 700 cm-1處有C=O的伸縮振動(dòng)峰，PIME的譜圖在1 200 cm-1處有C—O的特征峰，而PIMB的譜圖中并未出現(xiàn)此特征峰，證明兩種物質(zhì)的聚合反應(yīng)均已成功。圖2(b)為PIMB和PIME的核磁共振氫譜表征，其中左圖為聚離子液體PIMB各峰歸屬：8.3 ppm為咪唑環(huán)上—CH—的化學(xué)位移，7.4 ppm為咪唑環(huán)上—CH2—的化學(xué)位移，4.2 ppm為咪唑環(huán)鄰位—CH2—的化學(xué)位移，1.8 ppm為主鏈結(jié)構(gòu)丁二胺—CH2—的化學(xué)位移。右圖為聚離子液體PIME各峰歸屬：8.3 ppm為咪唑環(huán)上—CH—的化學(xué)位移，7.4 ppm為咪唑環(huán)上—CH2—的化學(xué)位移，3.7 ppm為咪唑環(huán)鄰位—CH2—的化學(xué)位移，3.5 ppm為主鏈結(jié)構(gòu)二氧雜辛烷—CH2—的化學(xué)位移。

圖2 (a).PIMB和PIME的紅外光譜圖;(b).PIMB和PIME的核磁氫譜圖 Fig.2 (a).FT-IRof PIMB and PIME;(b).1HNMR of PIMB and PIME

3.2 含炔基咪唑鹽類聚離子液體的粒徑和電荷大小測(cè)量

由圖3(a)可知，所制備的聚離子液體PIMB和PIME的特征粒徑分別在128 nm和142 nm，這與PIME的分子量大于PIMB相符[15]。圖3(b)為聚離子液體PIMB和PIME的Zeta電位測(cè)試結(jié)果，可見PIME所帶電荷量大于PIMB。

圖3 (a).聚離子液體PIMB和PIME的粒徑分析圖;(b).聚離子液體PIMB和PIME的Zeta電位圖(n=4, *P≤0.05)Fig.3 (a).Particle size analysis diagram of PIMB and PIME;(b).Zeta potential diagramof PIMB and PIME(n=4, *P≤0.05)

3.3 含炔基咪唑鹽類聚離子液體抗菌能力和細(xì)胞毒性測(cè)試

PIMB和PIME的抗菌能力測(cè)試見圖4，細(xì)胞毒性測(cè)試見表1。

圖4 (a).PIMB和PIME作用前后細(xì)菌的熒光染色抗菌測(cè)試;(b).PIMB和PIME作用前后細(xì)菌的細(xì)胞染色圖Fig.4 (a).Fluorescence staining antibacterial test exposure to PIMB and PIME;(b).Cell staining image exposure to PIMB and PIME

表1 PIMB和PIME的抗菌能力和細(xì)胞毒性Table 1 Antibacterial and cytotoxic of PIMB and PIME

由圖4(a)可知，在PIMB和PIME作用120 min之后，細(xì)菌的熒光染色由綠色變?yōu)榱思t色，表明兩種含炔基咪唑鹽類聚離子液體在120 min內(nèi)，能有效殺死細(xì)菌。含炔基咪唑鹽類聚離子液體對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌性能見表1，結(jié)果顯示兩種聚離子液體都能有效殺滅大腸桿菌(E.coli)和金黃色葡萄球菌(S.aureus)，這是由于含炔基咪唑鹽類聚離子液體中正電荷的咪唑鹽官能團(tuán)與帶有負(fù)電荷細(xì)菌細(xì)胞壁/膜表面相互吸引，通過靜電作用粘附到細(xì)菌表面，抗菌劑的疏水部分(如烷基鏈)插入細(xì)菌細(xì)胞壁/膜的疏水區(qū)域，對(duì)其進(jìn)行擾動(dòng)，導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞，最后細(xì)菌裂解而亡[8]。比較兩種物質(zhì)的MIC發(fā)現(xiàn)，PIME的抗菌性能高于PIMB，這也符合上述Zeta電位的測(cè)試結(jié)果。

此外，對(duì)于抗菌材料而言，其細(xì)胞毒性的大小是必須檢測(cè)的性能，通過CCK-8試劑測(cè)定了含炔基咪唑鹽類聚離子液體對(duì)人體皮膚的成纖維細(xì)胞的毒性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所有含炔基咪唑鹽類聚離子液體的細(xì)胞存活率均大于90%，表現(xiàn)出良好的細(xì)胞相容性，見表1。并且，通過將兩種含炔基的咪唑鹽類聚離子液體和細(xì)胞共培養(yǎng)48 h后的熒光染色圖可知，兩者對(duì)細(xì)胞的細(xì)胞狀態(tài)并無(wú)影響，見圖4(b)。

4 結(jié)論

本研究主要通過縮聚反應(yīng)制備不同主鏈結(jié)構(gòu)的含炔基的咪唑鹽類聚離子液體，并對(duì)其化學(xué)結(jié)構(gòu)、細(xì)胞毒性和抗菌性能進(jìn)行了一系列表征。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，含炔基的咪唑鹽類聚離子液體由于其較強(qiáng)的正電效應(yīng)，對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均具有較強(qiáng)的抗菌性，而且對(duì)人體皮膚的成纖維細(xì)胞具有較低的細(xì)胞毒性，未來(lái)可作為一種生物相容性較好的抗菌劑，廣泛應(yīng)用于醫(yī)用敷料中。