奶牛乳腺健康與乳中體細胞數之間關系的研究進展
2021-04-13 13:14:34詹經緯童津津熊本海蔣林樹
動物營養學報 2021年3期
詹經緯 童津津* 熊本海 蔣林樹
(1.北京農學院動物科學技術學院，奶牛營養學北京市重點實驗室，北京102206；2.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，北京100193)
乳腺炎是全球乳業最流行、造成經濟損失最大的疾病之一，如果能在乳腺炎之前更早地發現乳腺內感染，并進行隔離、治療等相應措施，將極大地減少牛場經濟損失。乳中體細胞數(somatic cell count，SCC)升高是乳腺內感染、乳腺損傷的結果，會影響奶牛的泌乳性能[1]，同時乳中和血液中免疫相關蛋白和細胞因子會發生相應的變化[2-4]。雖然SCC能在一定程度上反映乳腺的健康狀況，但很多研究發現僅僅通過SCC來判斷乳腺健康是不嚴格的，存在一定的局限性[5-7]。目前，國內外已有諸多報道提出了新指標體細胞分型指數(differential somatic cell count，DSCC)，表明其可以作為SCC的附加指標來監測奶牛乳腺內感染情況，能在低SCC的奶牛中檢測出處于炎癥早期的奶牛，揭示發病奶牛處于炎癥的何種階段，并且可以反映奶牛的乳腺健康及泌乳性能的狀態[8-10]。本文圍繞以上主題，結合國內外近年來的研究成果進行綜述。
1 乳中SCC作為指示乳腺炎的指標
乳腺炎是乳腺組織發生的一種炎癥反應，表現為牛乳成分異常、產奶量下降等問題。誘發因素較多，主要包括病原微生物侵襲、營養不良、環境不適、擠奶方式不當等，但細菌感染是造成乳腺炎的最主要病因[1]。傳染性病原菌(包括無乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、牛棒狀桿菌等)是檢出率最高的病原菌，引起奶牛臨床型乳腺炎和隱型乳腺炎。環境型病原菌(包括乳腺鏈球菌、埃希氏大腸桿菌、變形桿菌等)通常引起臨床型乳腺炎[11]。機會型病原菌如凝固酶陰性葡萄球菌(CNS)通常引起隱型乳腺炎。由于隱型乳腺炎給奶牛泌乳帶來不利影響的同時，不易被發現且具有傳染性，對牛場造成的經濟損失更為嚴重。
牛乳中的SCC指每毫升牛乳中的總細胞數，多數是免疫細胞(即巨噬細胞、嗜中性粒細胞和淋巴細胞)，約占SCC的99%；乳腺組織脫落的上皮細胞約占1%[12]。當奶牛發生乳腺內感染(intramammary infection，IMI)，乳中SCC升高，尤其是白細胞數目明顯增長，原因是細菌及其代謝物誘導嗜中性粒細胞(PMN)進入乳腺[13]。因此，乳中SCC能很好地反映奶牛乳腺的健康狀況和乳品質，正常情況下牛乳中的SCC小于20萬個/mL，而當乳腺有外傷或者發生乳腺炎時SCC會超過20萬個/mL[14]。有研究表明，引起SCC變化的因素很多，隨著奶牛年齡及胎次的增加，SCC有升高的趨勢[15]。可能的原因有多種，老齡奶牛的乳頭管更容易發生損傷，愈合更慢，增加了細菌侵入的機會，且其免疫機能下降，清除病原菌的效率降低。此外，產犢初期奶牛乳中的SCC也顯著升高，這是因為此時機體免疫力較低，病原菌容易入侵并增殖[16]。夏季的SCC在1年內最高，因為夏季細菌最活躍，奶牛出現熱應激的情況也增多，導致乳腺炎的發病率增加。研究發現，泌乳末期的奶牛SCC也增高，這是產奶量降低產生的結果，但不患隱型乳腺炎的奶牛這種現象不明顯[15]。雖然引起SCC升高的原因有很多，但最主要的因素是乳腺炎的發生。因此，對于肉眼無法判別病癥的奶牛，可以檢測SCC判斷其是否患有隱型乳腺炎。
2 乳中SCC與乳腺健康相關性研究
當乳腺內感染發生后，病原菌增殖使乳腺上皮細胞開始損傷，若感染持續存在，乳腺內SCC不斷增加導致乳腺組織損傷惡化，最終腺體中腺泡完整結構被破壞，血乳屏障受損，產生炎癥反應[17]。因此，SCC升高早于乳腺炎的發生，這是乳腺健康狀態受損，機體啟動免疫反應的結果，并且會影響奶牛的泌乳性能。所以，檢測牛乳中的SCC來判斷乳腺健康狀況具有一定的指示性。
2.1 乳中SCC變化與泌乳性能相關性研究
健康牛乳中SCC應小于20萬個/mL，當乳腺發生感染時，最重要的表現就是SCC發生不同程度的升高，引起奶牛泌乳性能的變化，主要包括奶牛的產奶量、牛乳中乳蛋白率、乳糖率和乳脂率的變化等[18-19]。目前，關于乳中SCC與產奶量及乳成分的相關性研究得到了廣泛關注，SCC可作為表型特征指示乳品質量，其升高通常是因為乳腺內已經發生了感染，感染區PMN數劇烈增長；若感染未及時消除，則會導致乳腺炎的發生，SCC進而持續升高[20]。Costa等[21]對意大利地區大規模牛場的奶牛數據進行統計，發現SCC逐漸升高的情況下，產奶量和乳糖含量顯著降低，但對乳脂率和乳蛋白率無顯著影響。祝語等[22]對昆明地區某牛場3 000頭奶牛的生產性能測定(dairy herd improvement，DHI)數據進行相關分析發現，SCC與乳蛋白率呈極顯著正相關，與乳糖含量呈極顯著負相關，但不同SCC組間乳脂率差異不顯著。韓麗云等[23]將寧夏地區325頭荷斯坦奶牛SCC數據轉化為體細胞評分(SCS)，發現乳中SCS與日產奶量呈顯著負相關，與乳糖含量呈正相關，但與乳脂率無顯著相關性。田悅珍等[24]對新疆2個牛場1 500余條DHI數據分析發現，隨著新疆褐牛乳中SCC增加，產奶量、乳糖率和乳脂率均下降。
以上各地區對奶牛SCC與泌乳性能相關分析表明，乳中SCC的升高通常造成：1)產奶量下降[23-24]。因為高SCC的奶牛大多是由于乳腺內病原菌增多，這些細菌分泌毒素，造成乳腺上皮細胞損傷等，進而導致了產奶量下降。也有特殊情況，如CNS引發的乳腺早期感染，導致SCC升高的同時不會造成產奶量的下降[25]。2)乳蛋白率升高[22-23]。由于SCC的升高伴有血-乳屏障的滲透性增加，使得血液中的免疫球蛋白、乳鐵蛋白、白蛋白等流入乳中，從而導致了乳蛋白率的升高[26]。然而，這種牛乳中增加的乳蛋白通常是乳清蛋白和一些免疫蛋白，相反，對人體有益的酪蛋白顯著減少[27]，可能是因為活化素和腫瘤生長因子-β抑制了信號轉導和轉錄激活因子5(STAT5)反式激活和STAT5介導的轉錄，從而導致酪蛋白含量的下降[28]。因此這種乳蛋白率的增加對乳品質是有害的。3)乳糖率下降[22-24]。當SCC高時會強烈刺激奶牛機體發生免疫反應，造成奶牛精神不振，食欲不佳，飼糧攝入營養不足，從而在乳糖合成時D-半乳糖和D-葡萄糖供應不足，導致乳糖合成量下降[23]。同時，高SCC的奶牛乳腺組織損傷，毛細血管破裂，血液滲透進入乳中，導致血-乳之間的滲透壓降低，從而降低了乳糖向牛乳中的滲透[29]，并且乳腺上皮細胞的載體破損，導致乳糖的流失。4)對于乳脂率變化尚未有統一的定論。理論上SCC升高常常伴隨乳脂合成和分泌降低，并且使乳中含有大量游離脂肪酸，牛乳中會出現脂肪氧化，具有苦、澀等不良氣味[23]。有研究報道，隨著SCC的升高，乳脂率應呈現下降趨勢，但由于產奶量的減少，乳脂總量減少與濃縮效應產生抵消，故而各項研究中乳脂率差異不同[23-24]。
2.2 乳中SCC變化與抗氧化及免疫指標相關性研究
目前研究表明，當牛乳SCC變化時，乳汁或者血液中相關酶類物質、免疫球蛋白、急性期蛋白及細胞因子等含量或活性也隨之發生變化[2]。程艷艷等[3]發現高SCC組奶牛的血液和乳汁中的丙二醛(MDA)含量顯著高于低SCC組，而超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性隨著SCC的升高有遞減的趨勢。伊柏雙等[4]也發現了高SCC且已經發生乳腺炎的奶牛，血清中SOD、GSH-Px、過氧化氫酶(CAT)活性顯著低于健康奶牛，說明奶牛SCC越高，炎癥反應越嚴重，其抗氧化能力越差，這些指標可作為判定乳腺感染的依據。據報道，乳腺內起抗菌作用的免疫球蛋白(Ig)主要包括IgG1、IgG2、IgA和IgM[4]。其中IgG1、IgG2、IgM可作為調理素提高PMN和巨噬細胞的吞噬作用；而IgA主要通過凝聚入侵的細菌防止其在乳腺內擴散[30]。正常乳汁中的IgG1含量最高，細菌感染導致高SCC乳汁中免疫球蛋白含量增加，但不同病原菌感染引起的Ig含量變化有差異[4]。乳汁中IgG1、IgG2含量的增加可能是由大腸埃希氏桿菌毒力成分脂多糖(LPS)誘導，而乳汁中只有IgG2含量增加，IgG1含量不變則有可能是金黃色葡萄球菌毒力成分脂磷壁酸(LTA)誘導發生的[2]。
據報道，SCC與急性期蛋白、免疫相關蛋白及免疫因子有密切關系[31-33]。沈維軍等[19]在對高SCC牛乳蛋白成分的研究中發現，高SCC牛奶中增加的蛋白為急性期蛋白(如白蛋白、結合珠蛋白和α1酸性蛋白)和免疫相關蛋白(如轉鐵蛋白、乳鐵蛋白抗菌肽1和IgG等)。白蛋白在血漿中含量較高，血乳屏障受損后導致其流入牛乳。結合珠蛋白和α1酸性糖蛋白通常在肝內合成，PMN和乳腺細胞也可合成，乳腺炎剛開始時，可以觀察到這2種蛋白含量的迅速增加[31-32]。抗菌肽具有高抗菌活性，在機體自然免疫中發揮作用。因此，高SCC的牛乳中抗菌肽1含量的增加可能是機體啟動免疫反應、對抗感染的表現[33]。當乳腺剛感染時，乳腺上皮細胞釋放趨化因子白細胞介素-8(IL-8)，使PMN遷移到乳腺中造成SCC快速增長。PMN釋放炎性細胞因子[腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1(IL-1)、白細胞介素-12(IL-12)和趨化因子IL-8]，促進急性期炎癥反應，從而發揮相關的免疫功能，進而加強對病原菌的有效清除[17]。若是持續、慢性的炎癥，SCC不斷增加的同時，造成臨床型乳腺炎，則奶牛血清中IL-1β、IL-8和TNF-α的含量升高，但造成隱型乳腺炎的血清中這些細胞因子的差異不顯著[17,34]。
3 DSCC與乳腺健康的關系
3.1 乳中SCC檢測的局限性
國際乳業聯合會建議同時使用乳中SCC和細菌學分析來確定乳腺健康[35]。因此，奶牛乳腺是否感染應該以細菌學檢測作為參考標準(國際乳腺委員會，2004)。盡管如此，一些已感染乳腺炎的奶牛并未出現SCC增加，但細菌學分析呈假陰性結果[5]。特別是對于凝固酶陰性葡萄球菌，這種細菌可能是引發早期乳腺炎的潛在致病病原體，會造成SCC升高，但對奶牛生產性能無不利影響；有時它們只存在于乳頭皮膚上，會導致樣本的細菌學檢測呈假陽性結果，其實并非乳腺內感染[25]，那么對感染乳區的識別仍然存在困難。
乳中SCC判斷乳腺炎的發生，存在一定的局限性。在Schwarz等[5]對德國某牛群乳腺炎的研究中，對乳腺健康的標準很高，將區分乳腺是否感染的閾值確定為100 000個/mL。然而，即使在SCC≤100 000個/mL的乳汁中，出乎意料地檢測到了高數量的病原體。甚至在一些SCC為1 000個/mL左右的樣本中也檢測出主要病原體(金黃色葡萄球菌及無乳鏈球菌)和次要病原體(CNS及棒狀桿菌屬)，這使作者懷疑SCC為100 000個/mL的閾值無法判斷乳腺是否已經產生炎癥反應。汪悅等[25]在奶牛SCC研究中發現，在SCC<100 000個/mL時，乳腺內早期炎癥可能已經出現。然而有小部分樣品平均SCC>300 000個/mL，遠超過100 000個/mL的閾值，但其細菌學檢查結果呈陰性未感染。總而言之，在一些低SCC的奶牛乳腺中，實際可能已經發生了感染，但此時乳腺內以PMN的大量聚集為主，還不能檢測到SCC的顯著升高[6]；并且當某些細菌如金黃色葡萄球菌，感染乳腺后會釋放一種殺白細胞素，導致感染后SCC也不會明顯上升[7]。一些高SCC奶牛，甚至達到SCC>40萬個/mL，但此時其乳腺內病原菌已經被清除了，處于痊愈過程中，是由于炎癥反應依然活躍造成的高SCC[25]。因此，SCC計數雖是一種比較可靠的指示乳腺炎的指標，然而不能準確地判斷乳腺是否發生感染，也不能將牛奶中存在的體細胞區分為不同的類型[6]，僅僅依賴乳中SCC來判斷乳腺感染的情況是不嚴格的。
3.2 DSCC可以更明確地指示乳腺炎情況
在乳腺中，免疫細胞(主要為淋巴細胞、巨噬細胞和PMN)的數量和分布可以反映炎癥反應的進程[6]。隨著炎癥的發展，各種免疫細胞反應不同，只應用SCC來指示炎癥的發生，存在局限性[36]。已有多項研究[8,10,36-38]表明，DSCC有利于更明確地描述奶牛乳腺健康的實際情況，可以將PMN、淋巴細胞和巨噬細胞作為一個整體，DSCC代表PMN和淋巴細胞占整體的比例之和，巨噬細胞用100%減去DSCC得到[8]，這可以顯示不同細胞比例的變化并揭示炎癥反應正處于哪個階段，即使在SCC為1 000個/mL的樣本中，仍具有較好的指示效果[35]。Pillai等[9]在研究炎性細胞時發現，體細胞計數和PMN計數呈正相關關系，SCC較多的乳區其PMN數也比較高，并且相對于3次細菌學檢測陰性的乳區(PMN比例為17%～25%)，3次細菌學檢測陽性的乳區中PMN的比例更高(33%～59%)，這些均說明乳區發生感染后會導致SCC增加，并且很大一部分是由于PMN數的增加導致的。Schwarz等[28]研究發現，在極低SCC(<6 250個/mL)的樣本中，淋巴細胞的比例高達88%；在6 250個/mL
直到2017年，世界各地已經開發出了檢測細胞分型的方法，但還沒有高通量檢測DSCC的常規方法。Damm等[8]利用FOSS DSCC法測定DSCC等參數，并與現有的成熟方法進行比較，驗證了隨著SCC的增加，PMN的比例增加，巨噬細胞的比例減少，而淋巴細胞數量在整個炎癥過程中一直處于很低的狀態。因此，DSCC反映了PMN和巨噬細胞的反比例關系，并且該方法特異性、準確性和穩定性都很強，且為低成本、可重復、快速、準確并同時檢測單個牛乳樣本中的DSCC和SCC提供了方法，增加了將DSCC添入DHI框架內的可能。近幾年，有研究發現DSCC與乳品質存在顯著的相關性[37-38]。Zecconi等[37]對意大利地區牛群分析結果表明，發現在SCC很低的奶牛中，隨著DSCC增加，乳脂率、乳蛋白率特別是酪蛋白率顯著降低，那么DSCC可作為低SCC奶牛乳成分變化的標志。Stcco等[38]對DSCC與乳品質進行了進一步分析，發現DSCC的變化對乳中的乳脂率和乳糖率影響最大，分別呈負相關和正相關關系，特別是在DSCC剛開始上升時，可作為判斷這2種乳成分變化的依據。在高DSCC(DSCC≥78.5%)時，乳蛋白率和酪蛋白率顯著下降，且此時SCC的變化也影響酪蛋白率。因此，附加DSCC指標可用于農場(減少抗菌劑的使用)到奶廠(進一步評估牛奶品質和價值)的多重監控。
4 小 結
乳中SCC是一項比較可靠的判斷乳腺健康的指標，在我國已沿用多年，可粗略反映乳腺是否發生炎癥，并在一定程度上指示奶牛的泌乳性能和乳腺的健康狀態。若結合新參數DSCC可以更準確地監測乳腺健康，更早地發現感染奶牛，同時可以進一步判斷乳品質量。但是，DSCC在DHI框架內的實際應用還需要進一步的探討，乳腺感染的復雜性需要廣泛的縱向研究。
