不同維生素K3添加水平對1～21日齡北京鴨生長性能、脛骨質量和血漿生化指標的影響

申仲健 郝永勝 孫培新 吳永保 張 博 唐 靜 黃 葦 張 琪 侯水生 謝 明

(中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，動物營養學國家重點實驗室，北京100193)

維生素K是一組具有促凝血作用的脂溶性維生素[1-2]，主要包括維生素K1、維生素K2、維生素K3、維生素K4等。其中，維生素K1大量存在于綠色蔬菜和植物油中，維生素K2是一類可以從腸道細菌發酵獲得的活性物質[3]，而維生素K3和維生素K4是人類通過化學合成的產物。目前，畜禽飼糧中的維生素K主要為維生素K3[4]。維生素K主要通過參與羧化維生素K依賴蛋白發揮其凝血、骨骼礦化、抑制血管鈣化等生理作用[5-10]，凝血酶原前體蛋白維生素K缺乏或拮抗劑Ⅱ誘導蛋白(protein induced by vitamin K absence or antagonist-Ⅱ，PIVKA-Ⅱ)和骨鈣素分別是與凝血和骨骼礦化相關的維生素K依賴蛋白[11]，可作為機體維生素K營養狀況的評價指標。小鼠通過注射維生素K1可顯著降低血漿PIVKA-Ⅱ含量[12]，肉雞飼糧中添加維生素K3可顯著提高肉雞3周齡脛骨骨密度和顯著降低血清羧化不全骨鈣素含量[13]。NRC(1994)家禽營養需要標準中推薦育雛期北京鴨維生素K營養需要量為0.5 mg/kg，但該推薦量是依據其他家禽數據確定，缺乏肉鴨方面試驗依據。目前，維生素K對肉鴨生長發育影響的研究未見報道。因此，本試驗通過研究不同維生素K3添加水平對1～21日齡北京鴨生長性能、脛骨質量和凝血及骨代謝相關血漿生化指標的影響，探討反映肉鴨維生素K營養狀況的敏感指標，確定育雛期北京鴨維生素K營養需要參數，為肉鴨飼糧配制中維生素K的合理使用提供技術支撐和理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計及飼糧

試驗采用單因子完全隨機試驗設計，設7個維生素K3添加水平(0、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0和8.0 mg/kg)。試驗基礎飼糧營養水平參考我國《肉鴨飼養標準》( NY/T 2122—2012)，基礎飼糧組成及營養水平見表1。通過在基礎飼糧中添加7個不同水平人工合成維生素K3(0、0.98、1.96、3.92、7.84、11.76和15.68 mg/kg，按照甲萘醌含量進行換算)配制成7種試驗飼糧。維生素K3添加形式為亞硫酸氫鈉甲萘醌(甲萘醌含量為51%)，試驗飼糧均制成顆粒料。選擇448只1日齡健康雄性北京鴨，隨機分為7組，每組8個重復，每個重復8只鴨。各重復試驗鴨初始體重基本一致。試驗期為21 d。

表1 基礎飼糧組成及營養水平(風干基礎)

續表1項目 Items含量 Content營養水平 Nutrient levels2)代謝能 ME/(MJ/kg)12.18 粗蛋白質 CP19.99 鈣 Ca0.71 有效磷 AP0.35 賴氨酸 Lys1.10 蛋氨酸 Met0.45 蛋氨酸+半胱氨酸 Met+Cys0.80 蘇氨酸 Thr0.84 色氨酸 Trp0.25 精氨酸 Arg1.36

1.2 飼養管理

試驗鴨網上平養，自由采食與飲水，24 h光照。1～21日齡按試驗飼糧分組飼養，其他按常規飼養管理進行。

1.3 樣品采集和指標測定

1.3.1 生長性能

分別于1和21日齡稱取各組各重復試驗鴨空腹體重和剩余飼料重，計算1～21日齡試驗鴨平均日增重、平均日采食量和料重比。

1.3.2 血漿生化指標

使用采血針和真空采血管采集21日齡北京鴨血液，從各組各重復隨機挑選試驗鴨2只，頸靜脈采血5 mL，置于肝素鈉抗凝管中，3 500 r/min離心15 min，分離血漿，-20 ℃保存，用于血漿生化指標的測定。其中，血漿中鈣、磷含量和堿性磷酸酶活性采用HITACHI7080全自動生化分析儀進行測定分析，試劑盒購自邁克生物股份有限公司。血漿中PIVKA-Ⅱ含量采用雙抗體一步夾心法酶聯免疫吸附試驗(ELISA)法測定，采用上海酶聯公司生產的試劑盒并用BiotekEpoch酶標儀在450 nm波長下測定吸光度，計算血漿PIVKA-Ⅱ含量。血漿中骨鈣素和羧化不全骨鈣素含量同樣采用ELISA法測定，在450 nm波長下測定吸光度，試劑盒購自北京綠源伯德生物科技有限公司。通過血漿骨鈣素和羧化不全骨鈣素含量計算骨鈣素羧化率：

骨鈣素羧化率(%)=100×(血漿骨鈣素含量-
血漿羧化不全骨鈣素含量)/
血漿骨鈣素含量。

1.3.3 脛骨質量

于21日齡，從各組各重復隨機挑選試驗鴨2只，頸靜脈采血后，處死，取試驗鴨左側脛骨測定脛骨骨密度、骨礦鹽含量和骨面積，采用GE Lunar iDXA雙能X射線骨密度儀進行測定。

1.4 統計分析

試驗數據采用SAS 9.3統計軟件進行統計分析，采用GLM程序按完全隨機試驗設計進行單因素方差分析，采用Duncan氏法進行平均值之間的多重比較。試驗數據采用“平均值±標準差”表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結 果

2.1 不同維生素K3添加水平對1～21日齡北京鴨生長性能的影響

如表2所示，不同維生素K3添加水平對1～21日齡北京鴨平均日增重、平均日采食量和料重比均未產生顯著影響(P>0.05)。

表2 不同維生素K3添加水平對1～21日齡北京鴨生長性能的影響

2.2 不同維生素K3添加水平對21日齡北京鴨脛骨質量和骨代謝相關血漿生化指標的影響

如表3所示，不同維生素K3添加水平對21日齡北京鴨脛骨骨密度、骨礦鹽含量和骨面積均未產生顯著影響(P>0.05)。

不同維生素K3添加水平對21日齡北京鴨血漿鈣、磷含量和堿性磷酸酶活性產生顯著影響(P<0.05)。4.0 mg/kg維生素K3添加水平組血漿鈣含量顯著高于0、0.5、1.0 mg/kg維生素K3添加水平組(P<0.05)。0 mg/kg維生素K3添加水平組血漿磷含量顯著低于0.5、2.0、4.0、6.0、8.0 mg/kg維生素K3添加水平組(P<0.05)。2.0 mg/kg維生素K3添加水平組血漿堿性磷酸酶活性顯著高于0、0.5、1.0、8.0 mg/kg維生素K3添加水平組(P<0.05)。

2.3 不同維生素K3添加水平對21日齡北京鴨血漿維生素K依賴蛋白含量的影響

如表5所示，不同維生素K3添加水平對21日齡北京鴨血漿PIVKA-Ⅱ含量產生顯著影響(P<0.05)。8.0 mg/kg維生素K3添加水平組血漿PIVKA-Ⅱ含量最低，顯著低于0、0.5、1.0、2.0 mg/kg維生素K3添加水平組(P<0.05)。不同維生素K3添加水平對血漿羧化不全骨鈣素和骨鈣素含量產生顯著影響(P<0.05)。0 mg/kg維生素K3添加水平組血漿羧化不全骨鈣素含量顯著高于0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mg/kg維生素K3添加水平組(P<0.05)，并且血漿骨鈣素含量也顯著高于0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mg/kg維生素K3添加水平組(P<0.05)。不同維生素K3添加水平對21日齡北京鴨骨鈣素羧化率未產生顯著影響(P>0.05)。

表3 不同維生素K3添加水平對21日齡北京鴨脛骨質量的影響

表4 不同維生素K3添加水平對21日齡北京鴨骨代謝相關血漿生化指標的影響

表5 不同維生素K3添加水平對21日齡北京鴨血漿維生素K依賴蛋白的影響

3 討 論

3.1 不同維生素K3添加水平對1～21日齡北京鴨生長性能的影響

研究發現，飼糧中添加維生素K3未顯著提高豬生長育肥階段的平均日采食量、平均日增重和料重比[14-15]，同時對1～3周齡肉雞生長性能的影響也不顯著[13]。Price等[16]給大鼠持續服用維生素K拮抗劑造成大鼠維生素K缺乏，但未對大鼠平均日增重產生顯著影響。有關維生素K對北京鴨生長性能影響的研究還未見報道。本試驗結果顯示，飼糧中添加不同水平維生素K3對1～21日齡北京鴨的平均日采食量、平均日增重和料重比均無顯著影響，這與上述研究報道基本一致。然而，維生素K對動物生長性能的影響與維生素K缺乏持續時間有關。Zhang等[13]研究發現，盡管維生素K缺乏對1～3周齡肉仔雞平均日增重沒有顯著影響，但持續飼喂維生素K缺乏飼糧7周以后可顯著降低6～7周齡肉仔雞平均日增重。由此可見，維生素K對肉鴨生長發育的影響在生長性能等宏觀指標上可能體現較弱，研究應注重維生素K對機體生理生化機能的影響。

3.2 不同維生素K3添加水平對21日齡北京鴨脛骨質量和骨代謝相關血漿生化指標的影響

Price等[16]研究發現，服用維生素K拮抗劑組的大鼠與對照組大鼠脛骨密度無顯著差異，骨質疏松患者補充維生素K后骨密度并沒有顯著升高，但在臨床上補充維生素K可降低患者的骨折風險[17]。本試驗結果顯示，飼糧中添加不同水平維生素K3對21日齡北京鴨的脛骨骨密度、骨礦鹽含量和骨面積都沒有產生顯著影響，這與上述研究結果基本一致。但本試驗結果表明提高飼糧維生素K3添加水平可促進鈣、磷吸收及代謝，表現在提高飼糧維生素K3添加水平可提高血漿鈣、磷含量。這與肉雞方面的研究結果[13]相一致。堿性磷酸酶是成骨細胞骨礦化的標志物，堿性磷酸酶活性升高間接反映成骨細胞代謝更活躍。醫學臨床上給骨折早期患者補充較高水平維生素K4可顯著提高患者血清堿性磷酸酶活性[18]。大鼠離體骨細胞培養試驗也表明，維生素K2能夠顯著增強血清堿性磷酸酶活性[19]。本試驗中2.0 mg/kg維生素K3添加水平組血漿堿性磷酸酶活性顯著高于0、0.5、1.0、8.0 mg/kg維生素K3添加水平組的結果在一定程度上支持了上述研究報道。由此可見，維生素K可能通過參與體內鈣、磷代謝調控機體骨骼發育。然而本試驗尚未觀察到不同維生素K3添加水平對北京鴨脛骨質量產生顯著影響，這有待于進一步研究。

3.3 不同維生素K3添加水平對21日齡北京鴨血漿維生素K依賴蛋白含量的影響

凝血功能是維生素K的主要生理功能[14,20-23]，凝血酶原前體蛋白PIVKA-Ⅱ是與凝血相關的維生素K依賴蛋白，血漿PIVKA-Ⅱ含量也是目前最敏感的凝血指標，能夠預測機體維生素K缺乏的亞臨床狀況[24-25]，當機體維生素K缺乏時，PIVKA-Ⅱ在肝臟中未能及時的被羧化成為凝血酶原，隨后PIVKA-Ⅱ在血液中累積，而PIVKA-Ⅱ無法被激活成為凝血酶發揮凝血功能，血液中PIVKA-Ⅱ含量過高反映出凝血功能出現障礙[5,24,26]。本試驗結果顯示，血漿PIVKA-Ⅱ含量隨維生素K3添加水平升高而降低，且在飼糧維生素K3添加水平達到8.0 mg/kg時最低，這間接反映出維生素K缺乏可影響肉鴨的凝血功能。

此外，骨鈣素也是維生素K的依賴性蛋白[11,27]，當機體維生素K缺乏時，部分骨鈣素無法在維生素K的作用下完成羧化反應，血液中羧化不全骨鈣素含量會大大增加[28]，進而導致血液中骨鈣素的含量也隨之增加，肉雞飼糧中添加維生素K3可顯著降低血清羧化不全骨鈣素含量[13]。因此，羧化不全骨鈣素是維生素K缺乏的生物標志物，可作為評價維生素K營養狀況的敏感指標[27,29]。羧化后的骨鈣素對羥基磷灰石晶體具有高親和力，使其沉積到骨基質中，骨鈣素羧化率和骨密度在臨床上常用來作為骨質疏松的診斷標準[29]，同時血漿羧化不全骨鈣素含量也被認為是評估骨折風險的敏感指標[30]。本試驗結果顯示，飼糧中添加維生素K3可顯著降低北京鴨血漿羧化不全骨鈣素含量。這間接表明維生素K3參與了骨鈣素的羧化，這與本試驗中高維生素K3添加水平組骨鈣素羧化率升高相一致，也與飼糧中添加高水平維生素K3可顯著提高北京鴨血漿鈣含量的結果相一致。這在一定程度上表明，維生素K3可通過提高骨鈣素的羧化水平促進肉鴨對鈣的吸收或動員。

目前，關于肉鴨維生素K3營養需要的研究未見報道。盡管本試驗設置了7個維生素K3添加水平，但尚不能成功通過構建數學模型計算出北京鴨對維生素K3的適宜需要量。參考方差分析和平均值之間多重比較，與未添加維生素K3組相比，0.5 mg/kg維生素K3添加水平組血漿磷含量顯著升高，而血漿羧化不全骨鈣素含量顯著降低。這支持NRC(1994)家禽營養需要標準中育雛期北京鴨維生素K3的推薦量(0.5 mg/kg)。同時，維生素K3添加水平高于0.5 mg/kg對升高血漿磷含量和降低血漿羧化不全骨鈣素含量沒有進一步顯著改善作用。這提示在本試驗條件下，以血漿磷羧化不全骨鈣素含量為評價指標，1～21日齡北京鴨飼糧中維生素K3適宜添加水平為0.5 mg/kg。同時，在飼糧中添加8.0 mg/kg維生素K3可顯著降低血漿中未羧化的凝血酶原前體蛋白PIVKA-Ⅱ和羧化不全骨鈣素含量的試驗結果也暗示著，在特定情況下為促進血液凝集功能和骨代謝相關機能，飼糧中維生素K3的添加水平可適當提高。

4 結 論

飼糧中添加維生素K3可能通過參與羧化影響凝血酶原前體蛋白PIVKA-Ⅱ、骨鈣素等維生素K依賴蛋白的調控，進而影響機體的血凝功能和骨代謝。綜合血漿磷和羧化不全骨鈣素含量，育雛期北京鴨飼糧維生素K3適宜添加水平為0.5 mg/kg。